检测局部和外周γδ T细胞频率
评估OLP患者病变组织和外周血中γδ T细胞的比例变化。
通过流式细胞术检测OLP病变组织和外周血中CD3+γδ TCR+细胞的比例,并与健康对照比较。
Aberrant Activation of the STING-TBK1 Pathway in γδ T Cells Regulates Immune Responses in Oral Lichen Planus.
包含患者样本流式、免疫组化、多色免疫荧光和Western blot等多个实验层级,但缺乏功能验证或机制干预实验。
口腔扁平苔藓患者病变组织 外周血单个核细胞(PBMC) 健康对照口腔黏膜组织
样本量:OLP患者39例,健康对照27例 流式检测:外周血γδ T细胞比例,病变组织γδ T细胞及其表型 Western blot:病变组织中γδ TCR、STING、TBK1、p-STING、p-TBK1、IFN-γ、IL-17A、CCR6、HLA-DR蛋白表达 多色免疫荧光:γδ TCR、STING、TBK1共定位
提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
评估OLP患者病变组织和外周血中γδ T细胞的比例变化。
通过流式细胞术检测OLP病变组织和外周血中CD3+γδ TCR+细胞的比例,并与健康对照比较。
检测γδ T细胞上活化及抗原呈递相关分子的表达。
通过流式细胞术检测局部和外周γδ T细胞上CD69、NKG2D、HLA-DR、TLR4及IFN-γ的表达。
探究STING-TBK1通路在OLP病变γδ T细胞中的激活及定位。
通过免疫组化检测病变组织中STING和TBK1表达,通过多色免疫荧光观察γδ TCR、STING和TBK1的共定位。
定量检测OLP病变组织中γδ T细胞相关及STING-TBK1通路蛋白的表达水平。
通过Western blot检测病变组织中γδ TCR、STING、TBK1、p-STING、p-TBK1、IFN-γ、IL-17A、CCR6和HLA-DR蛋白水平,并以β-actin为内参。
按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 样本制备 | 红细胞裂解液 | Beyotime | C3702 |
| RPMI-1640培养基 | Biological Industries | BISH0266 | |
| 青霉素-链霉素-庆大霉素溶液 | Solarbio | P1410 | |
| 无RNA酶的DNase I | Vazyme | EN401-01 | |
| I型胶原酶 | Biosharp | BS032A | |
| 细胞刺激 | 细胞活化混合物 | Biolegend | 423303 |
| 流式细胞术 | 抗CD3-FITC抗体 | BioLegend | 300406 |
| 抗TCRγδ-PE抗体 | BioLegend | 331210 | |
| 抗HLA-DR-APC-H7抗体 | BD Pharmingen | 561358 | |
| 抗TLR4-Percp5.5抗体 | BD OptiBuild | 745946 | |
| 抗NKG2D-APC抗体 | BD Pharmingen | 558071 | |
| 抗TCRαβ-PE抗体 | BioLegend | 306708 | |
| 抗CD69-PE-Cy7抗体 | BioLegend | 310912 | |
| 抗TLR4-BV421抗体 | BioLegend | 312811 | |
| 固定缓冲液 | Biolegend | 420801 | |
| 胞内染色透化洗液 | Biolegend | 421002 | |
| 抗IFN-γ-BV650抗体 | BD Horizon | 563416 | |
| CytoFLEX LX流式细胞仪 | Beckman Coulter | -- | |
| 免疫组化 | 抗γδ TCR抗体 | Thermo Fisher | 5A6.E9 |
| 抗STING抗体 | Cell Signaling Technology | D2P2F | |
| 抗TBK1抗体 | Abcam | EP611Y | |
| DAB显色液 | -- | -- | |
| Image Pro Plus 6.0软件 | Media Cybernetics | -- | |
| 多色免疫荧光 | 多色免疫组化/免疫荧光染色试剂盒 | Absin | abs50012 |
| Leica SP8共聚焦显微镜 | Leica | -- | |
| Western blot | BCA蛋白定量试剂盒 | Thermo Scientific | -- |
| 聚偏二氟乙烯膜 | Millipore Corporation | -- | |
| 抗p-STING抗体 | Cell Signaling Technology | E9A9K | |
| 抗p-TBK1抗体 | Cell Signaling Technology | D52C2 | |
| 抗IFN-γ抗体 | Abclonal | A12450 | |
| 抗IL-17A抗体 | Bioworld | BS6041 | |
| 抗HLA-DR抗体 | Nonus | NBP2-67610 | |
| 抗CCR6抗体 | Bioss | BS-1542R | |
| 增强化学发光检测试剂盒 | Applygen | -- | |
| 抗β-actin抗体 | Proteintech | 66009-1-Ig | |
| Image J软件 | NIH | -- |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 样本采集 | OLP患者39例,健康对照27例;年龄、性别匹配;OLP诊断标准(改良WHO标准);排除口腔苔藓样病变和不典型增生。 阅读提示:Methods 2.1 Participants and Samples |
| 流式细胞术 | 外周血PBMC分离及组织消化条件;抗体克隆号及荧光标记;细胞刺激条件(PMA/ionomycin/brefeldin A,6小时);检测分子:CD3, TCRγδ, TCRαβ, CD69, NKG2D, HLA-DR, TLR4, IFN-γ。 阅读提示:Methods 2.2 and 2.3 |
| 免疫组化 | 组织切片厚度4μm;抗原修复条件(柠檬酸钠缓冲液,微波20分钟);抗体稀释度(抗γδ TCR 1:10;抗STING 1:200;抗TBK1 1:250);阳性染色测量(IOD,至少4个随机视野,400×)。 阅读提示:Methods 2.4 Immunohistochemistry Assay |
| 多色免疫荧光 | 切片厚度4μm;抗体及稀释度同上;TSA染料使用顺序(520, 570, 650);抗原修复每轮前后进行;共聚焦显微镜(Leica sp8)。 阅读提示:Methods 2.5 Multiplex Immunofluorescence Staining |
| Western blot | 蛋白上样量40μg;SDS-PAGE凝胶浓度12%;一抗信息(anti-γδ TCR, anti-STING, anti-TBK1, anti-p-STING, anti-p-TBK1, anti-IFN-γ, anti-IL-17A, anti-CCR6, anti-HLA-DR);内参β-actin;样本量:CON n=3,OLP n=3,NEOLP n=2,EOLP n=2。 阅读提示:Methods 2.6 Western Blotting Analysis and Figure 6 legend |