口腔扁平苔藓中γδ T细胞STING-TBK1通路的异常激活调节免疫反应

Aberrant Activation of the STING-TBK1 Pathway in γδ T Cells Regulates Immune Responses in Oral Lichen Planus.

作者信息Shan Huang, Ya-Qin Tan, Gang Zhou
PMID36979934
发布时间2023-03
DOI10.3390/biomedicines11030955

实验完整度

中

包含患者样本流式、免疫组化、多色免疫荧光和Western blot等多个实验层级,但缺乏功能验证或机制干预实验。

主要模型

口腔扁平苔藓患者病变组织 外周血单个核细胞(PBMC) 健康对照口腔黏膜组织

重点核对

样本量:OLP患者39例,健康对照27例 流式检测:外周血γδ T细胞比例,病变组织γδ T细胞及其表型 Western blot:病变组织中γδ TCR、STING、TBK1、p-STING、p-TBK1、IFN-γ、IL-17A、CCR6、HLA-DR蛋白表达 多色免疫荧光:γδ TCR、STING、TBK1共定位

摘要

口腔扁平苔藓(OLP)是一种慢性T细胞介导的炎症性疾病。干扰素(IFN)-γ被认为对OLP免疫反应至关重要。一种突出的先天样淋巴细胞亚群,γδ T细胞,跨越先天-适应性连续体,并通过产生包括IFN-γ在内的多种细胞因子发挥免疫效应功能。γδ T细胞在OLP发病机制中的参与和机制仍不清楚。通过流式细胞术和免疫组织化学分别检测了OLP患者病变组织和外周血中γδ T细胞的表达。使用流式细胞术检测了OLP患者γδ T细胞上的人白细胞抗原-DR(HLA-DR)、分化簇(CD)69、Toll样受体(TLR)、自然杀伤组2成员D(NKG2D)和IFN-γ。此外,通过多色免疫荧光评估了γδ T细胞中干扰素基因刺激因子(STING)-TANK结合激酶1(TBK1)通路的参与。采用Western blotting研究OLP中γδ T细胞的调控机制。OLP患者病变组织中γδ T细胞显著上调,而外周血中的γδ T细胞下调。同时,检测到OLP中局部CD69+和NKG2D+ γδ T细胞以及外周HLA-DR+和TLR4+ γδ T细胞频率增加。此外,在OLP病变的γδ T细胞中观察到STING和TBK1的显著共定位。另外,增强的IFN-γ和白细胞介素(IL)-17A与OLP中活化的STING-TBK1通路和γδ T细胞正相关。总之,活化的γδ T细胞中上调的STING-TBK1通路可能参与调节OLP的免疫反应。

实验结论

提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。

研究问题
γδ T细胞是否参与口腔扁平苔藓的免疫病理过程,以及STING-TBK1通路在此过程中的作用?
核心机制
在OLP病变中,γδ T细胞中STING-TBK1通路的异常激活可能通过促炎性γδ T细胞与角质形成细胞之间的相互作用调节免疫反应。
主要证据
病变组织中γδ T细胞显著增加,且STING、TBK1及其磷酸化形式表达升高,并与γδ T细胞共定位;同时IFN-γ和IL-17A水平升高且与通路激活正相关。
研究意义
研究提示靶向γδ T细胞和STING-TBK1通路可能成为重新定义OLP免疫调节机制的潜在靶点。

研究路径

按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

1

检测局部和外周γδ T细胞频率

评估OLP患者病变组织和外周血中γδ T细胞的比例变化。

通过流式细胞术检测OLP病变组织和外周血中CD3+γδ TCR+细胞的比例,并与健康对照比较。

2

鉴定γδ T细胞表型

检测γδ T细胞上活化及抗原呈递相关分子的表达。

通过流式细胞术检测局部和外周γδ T细胞上CD69、NKG2D、HLA-DR、TLR4及IFN-γ的表达。

3

检测STING-TBK1通路表达及共定位

探究STING-TBK1通路在OLP病变γδ T细胞中的激活及定位。

通过免疫组化检测病变组织中STING和TBK1表达,通过多色免疫荧光观察γδ TCR、STING和TBK1的共定位。

4

Western blot分析蛋白表达

定量检测OLP病变组织中γδ T细胞相关及STING-TBK1通路蛋白的表达水平。

通过Western blot检测病变组织中γδ TCR、STING、TBK1、p-STING、p-TBK1、IFN-γ、IL-17A、CCR6和HLA-DR蛋白水平,并以β-actin为内参。

研究方法

按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。

产品清单

实验环节名称品牌货号
红细胞裂解液BeyotimeC3702
RPMI-1640培养基Biological IndustriesBISH0266
青霉素-链霉素-庆大霉素溶液SolarbioP1410
无RNA酶的DNase IVazymeEN401-01
I型胶原酶BiosharpBS032A
细胞活化混合物Biolegend423303
抗CD3-FITC抗体BioLegend300406
抗TCRγδ-PE抗体BioLegend331210
抗HLA-DR-APC-H7抗体BD Pharmingen561358
抗TLR4-Percp5.5抗体BD OptiBuild745946
抗NKG2D-APC抗体BD Pharmingen558071
抗TCRαβ-PE抗体BioLegend306708
抗CD69-PE-Cy7抗体BioLegend310912
抗TLR4-BV421抗体BioLegend312811
固定缓冲液Biolegend420801
胞内染色透化洗液Biolegend421002
抗IFN-γ-BV650抗体BD Horizon563416
CytoFLEX LX流式细胞仪Beckman Coulter--
抗γδ TCR抗体Thermo Fisher5A6.E9
抗STING抗体Cell Signaling TechnologyD2P2F
抗TBK1抗体AbcamEP611Y
DAB显色液----
Image Pro Plus 6.0软件Media Cybernetics--
多色免疫组化/免疫荧光染色试剂盒Absinabs50012
Leica SP8共聚焦显微镜Leica--
BCA蛋白定量试剂盒Thermo Scientific--
聚偏二氟乙烯膜Millipore Corporation--
抗p-STING抗体Cell Signaling TechnologyE9A9K
抗p-TBK1抗体Cell Signaling TechnologyD52C2
抗IFN-γ抗体AbclonalA12450
抗IL-17A抗体BioworldBS6041
抗HLA-DR抗体NonusNBP2-67610
抗CCR6抗体BiossBS-1542R
增强化学发光检测试剂盒Applygen--
抗β-actin抗体Proteintech66009-1-Ig
Image J软件NIH--

关键环节

汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

环节核对要点
样本采集
OLP患者39例,健康对照27例;年龄、性别匹配;OLP诊断标准(改良WHO标准);排除口腔苔藓样病变和不典型增生。
阅读提示:Methods 2.1 Participants and Samples
流式细胞术
外周血PBMC分离及组织消化条件;抗体克隆号及荧光标记;细胞刺激条件(PMA/ionomycin/brefeldin A,6小时);检测分子:CD3, TCRγδ, TCRαβ, CD69, NKG2D, HLA-DR, TLR4, IFN-γ。
阅读提示:Methods 2.2 and 2.3
免疫组化
组织切片厚度4μm;抗原修复条件(柠檬酸钠缓冲液,微波20分钟);抗体稀释度(抗γδ TCR 1:10;抗STING 1:200;抗TBK1 1:250);阳性染色测量(IOD,至少4个随机视野,400×)。
阅读提示:Methods 2.4 Immunohistochemistry Assay
多色免疫荧光
切片厚度4μm;抗体及稀释度同上;TSA染料使用顺序(520, 570, 650);抗原修复每轮前后进行;共聚焦显微镜(Leica sp8)。
阅读提示:Methods 2.5 Multiplex Immunofluorescence Staining
Western blot
蛋白上样量40μg;SDS-PAGE凝胶浓度12%;一抗信息(anti-γδ TCR, anti-STING, anti-TBK1, anti-p-STING, anti-p-TBK1, anti-IFN-γ, anti-IL-17A, anti-CCR6, anti-HLA-DR);内参β-actin;样本量:CON n=3,OLP n=3,NEOLP n=2,EOLP n=2。
阅读提示:Methods 2.6 Western Blotting Analysis and Figure 6 legend