鉴定circRBM33的m6A修饰及预后价值
验证circRBM33是否被m6A修饰，并评估其与PCa预后的关系
通过GSE113124和MeRIP测序鉴定circRBM33，Sanger测序确认反向剪接位点，meRIP实验验证m6A修饰，RNase R和放线菌素D实验检测稳定性，Kaplan-Meier生存分析评估预后
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
M6A修饰的circRBM33通过PDHA1介导的线粒体呼吸调控促进前列腺癌进展，并呈现为ARSI治疗的潜在靶点
M6A-modified circRBM33 promotes prostate cancer progression via PDHA1-mediated mitochondrial respiration regulation and presents a potential target for ARSI therapy.
实验完整度
高研究发现circRBM33被m6A修饰，体外细胞实验和体内异种移植模型验证其促肿瘤作用，机制上通过FMR1稳定PDHA1 mRNA促进线粒体呼吸，并评估了ARSI敏感性。
主要模型
前列腺癌细胞系（22Rv1、DU145、C4-2、PC-3等） 正常前列腺上皮细胞系RWPE-1 BALB/c裸鼠异种移植瘤模型
重点核对
circRBM33的m6A修饰水平及METTL3的作用 circRBM33与FMR1的相互作用及其m6A依赖性 PDHA1 mRNA稳定性及表达水平变化 ARSI（恩杂鲁胺/达罗他胺）处理浓度及时间 体内实验中肿瘤细胞注射数量及药物剂量
摘要
N6-甲基腺苷（m6A）是各类RNA（包括环状RNA（circRNA））中最普遍的RNA修饰。越来越多的证据表明，circRNA可能在多种恶性肿瘤中发挥关键作用。然而，circRNA的m6A修饰在前列腺癌（PCa）中的生物学相关性仍不清楚，需要阐明。我们的数据显示，circRBM33被m6A修饰，并且在PCa细胞中的表达高于正常细胞/组织。体外和体内实验表明，circRBM33的下调/上调分别抑制/促进肿瘤生长和侵袭。降低m6A水平可挽救circRBM33的促肿瘤作用。此外，一旦被m6A修饰，circRBM33通过形成二元复合物与FMR1相互作用，维持下游靶基因PDHA1的mRNA稳定性。抑制/过表达circRBM33降低/增加了ATP产生、乙酰辅酶A水平和NADH/NAD+比值。此外，circRBM33的缺失显著增加了前列腺肿瘤对雄激素受体信号抑制剂（ARSI）治疗（包括恩杂鲁胺和达罗他胺）的反应敏感性。我们的研究表明，m6A介导的circRBM33-FMR1复合物可以通过稳定PDHA1 mRNA激活线粒体代谢，从而促进PCa进展，并且减弱circRBM33可增加ARSI在PCa治疗中的有效性。这种新发现的circRNA可能成为PCa的潜在治疗靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- m6A修饰的circRBM33在前列腺癌进展中的生物学作用及机制，以及其与ARSI治疗反应的相关性
- 核心机制
- circRBM33被m6A修饰后与FMR1形成二元复合物，结合PDHA1 mRNA增强其稳定性，从而激活线粒体氧化磷酸化，促进PCa生长和转移
- 主要证据
- 体外细胞实验（CCK-8、集落形成、Transwell）显示circRBM33促进增殖和侵袭；体内异种移植实验显示circRBM33促进肿瘤生长；机制上通过MeRIP、RIP、ChIRP等验证circRBM33与FMR1相互作用及对PDHA1 mRNA稳定性的影响
- 研究意义
- circRBM33可作为PCa的潜在治疗靶点，尤其对于CRPC，抑制circRBM33可增强ARSI治疗效果
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证circRBM33在体外对PCa细胞增殖和侵袭的影响
确定circRBM33表达变化是否影响PCa细胞增殖和侵袭
在22Rv1和DU145细胞中敲低circRBM33，在C4-2和PC-3细胞中过表达，通过CCK-8、集落形成和Transwell实验检测细胞活力、集落形成能力和侵袭能力
验证circRBM33与FMR1的相互作用及其m6A依赖性
探究circRBM33是否与FMR1相互作用，且这种作用是否依赖于m6A修饰
利用FISH和核质分离确定circRBM33定位，ChIRP和RIP实验验证与FMR1的相互作用，通过METTL3敲低改变m6A水平，检测对circRBM33-FMR1相互作用的影响
评估FMR1对PCa细胞功能及预后的影响
确定FMR1是否促进PCa细胞侵袭性，并与其预后相关
通过siRNA敲低FMR1在22Rv1和DU145细胞中，CCK-8、集落形成、Transwell实验检测功能，使用GEPIA2数据库分析FMR1表达与DFS的关系，TMA分析FMR1与circRBM33的相关性
验证circRBM33对线粒体呼吸的影响
探究circRBM33是否通过影响线粒体呼吸促进PCa进展
通过qPCR和WB检测糖酵解和TCA循环关键酶表达，测量ATP、乙酰辅酶A和NAD+/NADH比值，并使用海马代谢分析仪检测OCR
验证FMR1对circRBM33介导的侵袭表型及线粒体呼吸的作用
确定FMR1是circRBM33介导的促癌效应所必需
在circRBM33过表达细胞中敲低FMR1，检测细胞增殖、集落形成、侵袭能力，以及ATP、乙酰辅酶A、NAD+/NADH和OCR的变化
验证circRBM33-FMR1复合物对PDHA1 mRNA稳定性的维持
确定circRBM33-FMR1复合物是否通过稳定PDHA1 mRNA来调节其表达
通过FMR1-RIP实验验证PDHA1 mRNA与FMR1的结合，RNA稳定性实验检测FMR1或circRBM33改变后PDHA1 mRNA半衰期变化
体内验证circRBM33对肿瘤生长的影响
验证circRBM33在体内对PCa肿瘤生长的促进作用
将circRBM33过表达或敲低的PCa细胞皮下注射至裸鼠，监测肿瘤体积和重量，IHC检测Ki67、FMR1和PDHA1表达
评估circRBM33敲低对ARSI治疗敏感性的影响
确定circRBM33敲低是否增强PCa细胞对ARSI治疗的反应
体外用恩杂鲁胺或达罗他胺处理circRBM33敲低细胞，检测细胞活力；体内构建皮下移植瘤，口服ARSI，比较肿瘤生长差异
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证细胞功能变化
验证免疫效应
评估体内效果
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 角质形成细胞无血清培养基 | -- | -- |
| 牛垂体提取物 | -- | -- | |
| 人重组表皮生长因子 | -- | -- | |
| RPMI-1640培养基 | -- | -- | |
| DMEM培养基 | -- | -- | |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 青霉素-链霉素溶液 | -- | -- | |
| 质粒构建 | pLC5-ciR质粒 | Geneseed | -- |
| pcDNA3.1 | Tsingke Biotechnology | -- | |
| pLKO.1 | Tsingke Biotechnology | -- | |
| 病毒包装 | 聚乙烯亚胺 | -- | -- |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Invitrogen | -- |
| NanoDrop分光光度计 | -- | -- | |
| TransScript® Uni一步法去gDNA和cDNA合成SuperMix | Transgen | -- | |
| PerfectStart® Green qPCR SuperMix | Transgen | -- | |
| RNA稳定性实验 | RNase R | -- | -- |
| 核质分离 | PARIS™试剂盒 | Ambion | -- |
| 蛋白提取 | RIPA裂解液 | -- | -- |
| Western blot | 聚偏二氟乙烯膜 | -- | -- |
| 化学发光成像系统 | CLiNX ChemiScope Touch | -- | |
| 药物处理 | STM2457 | Selleck | S9870 |
| 细胞活力检测 | CCK-8试剂盒 | Meilune | -- |
| VICTOR NivoTM多功能酶标仪 | PerkinElmer | -- | |
| 细胞侵袭实验 | Matrigel基质胶 | Corning | 354234 |
| 药物处理 | 恩杂鲁胺 | Selleck | S1250 |
| 达罗他胺 | MCE | HY-16985 | |
| FISH/IF | Ribo™荧光原位杂交试剂盒 | RIBOBIO | C10910 |
| 抗荧光淬灭封片液（含DAPI） | -- | P0131 | |
| 牛血清白蛋白 | -- | -- | |
| CoraLite488标记的山羊抗兔IgG (H+L)二抗 | Proteintech | SA00013 | |
| 共聚焦成像系统 | ZEISS | LSM 900 with Airyscan 2 | |
| 免疫组化 | 组织微阵列 | Shanghai Outdo Biotech Limited Company | HProA060PG01 |
| 病理切片扫描仪 | Leica | SDPTOP HS6 | |
| Ki67抗体 | Abcam | ab15580 | |
| FMR1抗体 | Proteintech | 13755-1-AP | |
| PDHA1抗体 | Proteintech | 18068-1-AP | |
| 动物实验 | BALB/c小鼠 | SPF (Beijing) Biotechnology Co., Ltd. | -- |
| 代谢检测 | NAD+/NADH检测试剂盒（WST-8法） | Beyotime | S0175 |
| 增强型ATP检测试剂盒 | Beyotime | S0027 | |
| 人乙酰辅酶A ELISA试剂盒 | MEIMIAN | AB-3528A | |
| XF-24细胞外流量分析仪 | Seahorse Bioscience | -- | |
| Seahorse XF细胞线粒体压力测试试剂盒 | Agilent | -- | |
| 机制研究 | 甲基化RNA免疫沉淀试剂盒 | BersinBio | Bes5203 |
| RNA免疫沉淀试剂盒 | BersinBio | Bes5101 | |
| 染色质分离RNA纯化（ChIRP）试剂盒 | BersinBio | Bes5104 | |
| 抗体 | FMR1抗体 | Cell Signaling Technology | #4317 |
| HK2抗体 | Cell Signaling Technology | #2867 | |
| PFKP抗体 | Cell Signaling Technology | #12746 | |
| PKM1/2抗体 | Cell Signaling Technology | #3186 | |
| LDHA抗体 | Cell Signaling Technology | #3582 | |
| TKT抗体 | Proteintech | 11039-1-AP | |
| G6PD抗体 | Proteintech | 25413-1-AP | |
| β-肌动蛋白抗体 | Proteintech | 66009-1-Ig | |
| AR抗体 | Proteintech | 22089-1-AP | |
| METTL3抗体 | ABclonal Technology | A8370 | |
| RBM33抗体 | Bioss | bs-21295R | |
| N6-甲基腺苷抗体 | Abcam | ab208577 | |
| AR-v7抗体 | Abmart | T55510 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | 细胞系来源：RWPE-1来自iCell Bioscience，LNCaP、C4-2、PC-3、DU145和22Rv1来自BeNa Culture Collection；培养基：RWPE-1使用K-SFM，LNCaP/C4-2/22Rv1使用RPMI-1640，PC-3/DU145使用DMEM；FBS浓度10%，青霉素-链霉素1% 阅读提示：Methods中的Cell Culture部分 |
| 质粒构建和病毒包装 | circRBM33过表达质粒pLC5-ciR，shRNA慢病毒由GeneChem合成，FMR1过表达pcDNA3.1，METTL3 shRNA pLKO.1 阅读提示：Methods中的Plasmids, Oligo RNA and Lentivirus部分 |
| RNA稳定性实验 | 放线菌素D浓度2 mg/ml，处理时间0、6、12、24小时（circRBM33）或0、3、6、9小时（PDHA1）；RNase R用量2 U/μg RNA，处理30分钟 阅读提示：Methods中的RNA Stability Assays部分 |
| 细胞功能实验 | CCK-8细胞数2000个/孔；集落形成细胞数1000个/孔，培养14天；Transwell细胞数6×10^4个/孔，培养24或48小时；基质胶品牌Corning，货号354234 阅读提示：Methods中的Cell Viability, Colony Formation and Invasion assays部分 |
| ARSI敏感性实验 | 恩杂鲁胺浓度10-100 μM，处理48小时；达罗他胺浓度10-100 μM，处理48小时 阅读提示：Methods中的Cell Viability, Colony Formation and Invasion assays部分 |
| FISH/IF | circRBM33探针浓度20 μM；使用RIBOBIO试剂盒C10910；DAPI封片液P0131 阅读提示：Methods中的Fluorescence in Situ Hybridization (FISH) and Immunofluorescence (IF)部分 |
| Western blot | 抗体品牌和货号：FMR1 (CST #4317)、METTL3 (ABclonal A8370)、PDHA1 (Proteintech 18068-1-AP)；转移膜0.45 μM PVDF 阅读提示：Methods中的Antibodies and Western blot部分 |
| 免疫组化 | TMA (HProA060PG01)来自上海芯超；抗体：Ki67 (Abcam ab15580)、FMR1 (Proteintech 13755-1-AP)、PDHA1 (Proteintech 18068-1-AP) 阅读提示：Methods中的Immunohistochemistry (IHC)部分 |
| 异种移植实验 | BALB/c裸鼠4周龄雄性，注射细胞数5×10^6个/侧；药物剂量：恩杂鲁胺20 mg/kg，达罗他胺50 mg/kg，口服28天；肿瘤体积计算0.5×长×宽^2 阅读提示：Methods中的Xenograft Experiment部分 |
| 代谢检测 | ATP检测试剂盒(Beyotime S0027)、NAD+/NADH试剂盒(Beyotime S0175)、乙酰辅酶A ELISA试剂盒(MEIMIAN AB-3528A)；海马实验细胞数2×10^4个/孔 阅读提示：Methods中的Acetyl-CoA and NAD+/NADH Ratios and ATP examination及Seahorse Metabolic Flux Assay部分 |
| 机制研究（RIP/ChIRP） | 试剂盒：MeRIP (BersinBio Bes5203)、RIP (BersinBio Bes5101)、ChIRP (BersinBio Bes5104)；探针由Genepharm合成 阅读提示：Methods中的Methylated RNA Immunoprecipitation (meRIP) and RIP Assay及Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP) Assay部分 |