体内CRISPRa筛选
鉴定促进HCC生长和转移的驱动基因。
使用人全基因组SAM2文库转导HEPG2细胞，构建原位肝癌模型，7周后分析肿瘤和肺转移灶中的sgRNA丰度。
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在小鼠模型中通过CRISPR激活筛选鉴定肝细胞癌生长和转移的驱动因子
CRISPR activation screening in a mouse model for drivers of hepatocellular carcinoma growth and metastasis.
实验完整度
高包含体内CRISPRa筛选、体外功能验证（CCK8、Transwell）、临床样本分析（TCGA、TMA）和免疫浸润分析，多个独立证据层级。
主要模型
HEPG2细胞 HUH7细胞 BALB/c裸鼠原位肝癌模型 HCC临床组织样本
重点核对
体内筛选使用HEPG2细胞，移植细胞数为4×10^6，接种于免疫缺陷BALB/c裸鼠肝内，7周后检测转移 体外验证使用HEPG2和HUH7细胞，transwell实验检测24小时（过表达）或48小时（siRNA）的侵袭 siRNA转染使用6 μL siRNA预混100 μL Opti-MEM，加入8 μL Lipo8000，转染5小时后更换培养基 使用TCGA数据（371例HCC和50例癌旁）进行Kaplan-Meier生存分析和Cox回归 免疫组化检测80例HCC组织中MYADML2蛋白表达，使用抗体bs-19119R（Bioss）
摘要
肝细胞癌（HCC）仍然是全球癌症相关死亡的主要原因。在这里，我们描述了一个通过CRISPR激活（CRISPRa）文库在体内进行全基因组筛选，以寻找HCC生长和转移的驱动因子。病理结果显示，经CRISPRa诱变后的细胞群在肺部形成了高度转移性肿瘤。体外验证表明，XAGE1B、PLK4、LMO1和MYADML2的过表达促进了细胞增殖和侵袭，而其抑制则抑制了HCC的进展。此外，我们报道了在HCC中高MYADML2蛋白水平表现出更差的总生存期，并且在60岁以上的患者中显著增加。此外，高MYADML2降低了对化疗药物的敏感性。有趣的是，免疫细胞浸润分析显示，树突状细胞、巨噬细胞等可能在HCC进展中发挥重要作用。总之，我们提供了一种在体内筛选与HCC侵袭和转移相关的功能基因的路线图，这可能为HCC的治疗提供新的潜在靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 哪些基因的激活能够驱动肝细胞癌的生长和转移？
- 核心机制
- XAGE1B、PLK4、LMO1和MYADML2的过表达促进HCC细胞增殖和侵袭，其高表达与不良预后相关，可能涉及免疫微环境中的M0巨噬细胞、单核细胞和树突状细胞等。
- 主要证据
- 通过体内CRISPRa筛选得到7个候选基因，体外功能实验（CCK8、Transwell）证实XAGE1B、PLK4、LMO1和MYADML2促进增殖和侵袭，siRNA抑制则相反；TCGA和TMA分析显示高表达与预后不良相关。
- 研究意义
- 为HCC的临床诊断、治疗和预后评估提供新的潜在生物学靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
生物信息学分析
从筛选结果中识别关键基因和通路。
对sgRNA进行深度测序，通过比较肺和肝中的sgRNA丰度划分基因类型，并进行KEGG和GO富集分析。
临床样本分析
评估候选基因的表达和预后价值。
利用TCGA数据库分析候选基因在HCC中的表达和生存关联，并用免疫组化验证MYADML2蛋白表达。
体外功能验证
验证候选基因对HCC细胞增殖和侵袭的影响。
在HEPG2和HUH7细胞中分别过表达或敲低候选基因，通过CCK8和Transwell实验检测细胞增殖和侵袭能力。
免疫浸润分析
探索候选基因与免疫细胞浸润的关系。
使用CIBERSORT分析TCGA数据中15种免疫细胞的比例，并比较高低表达组间的差异。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
体内筛选
验证细胞功能变化
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 抗体 | 抗MYADML2抗体 | Bioss | bs-19119R |
| 抗Vimentin抗体 | Servicebio | GB11192 | |
| 抗MMP9抗体 | Bioss | bs-4593R | |
| 抗VEGFa抗体 | Abcam | ab1316 | |
| 抗MYADML2抗体 | Novus Biologicals | NBP2-85342 | |
| 抗PLK4抗体 | Abclonal | A9863 | |
| 抗LMO1抗体 | Abclonal | A7561 | |
| 抗XAGE1B抗体 | Novus Biologicals | NB100-262SS | |
| 生物样本 | 人HCC标本 | Wellbiotech | LVC1607 |
| 细胞培养 | 杀稻瘟菌素 | MDBio | D0120601 |
| qPCR | Hieff TMqPCR SYBR Green Master Mix (LoW Rox Plus) | YEASEN | 11202ES08 |
| 细胞培养 | 胎牛血清 | Gibco | 1027-106 |
| MEM培养基 | Gibco | 31985070 | |
| DMEM培养基 | HyClone | SH30022-01B | |
| DNA提取 | HiPure组织DNA小提试剂盒 | Magen | D3125-02 |
| DNA纯化 | HiPure凝胶DNA纯化试剂盒 | Magen | D2111-03 |
| RNA提取 | 高纯度总RNA快速提取试剂盒（柱式） | BIOTEKE | RP1201 |
| 细胞增殖检测 | CCK8试剂盒 | Beyotime | C0039 |
| 病毒浓缩 | 通用病毒浓缩试剂盒 | Beyotime | C2901M |
| 细胞系 | HEK293T细胞 | Procell | RRID:CVCL_0063 |
| HEPG2细胞 | Procell | CL-0103 | |
| HUH7细胞 | Procell | CL-0120 | |
| 动物模型 | BALB/c裸鼠 | 实验动物中心 | SCXK (Yue) 2016-0029 |
| 质粒 | CRISPR/Cas9 SAM混合文库质粒 | Addgene | 1000000078 |
| MS2-P65-HSF1激活质粒 | Addgene | 89308 | |
| pCMV-VSV-G质粒 | GENEROL BIOL | -- | |
| pMDLg pRRE质粒 | GENEROL BIOL | -- | |
| pRSV-Rev质粒 | GENEROL BIOL | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 体内筛选 | 细胞系HEPG2，移植细胞数4×10^6，小鼠品系BALB/c裸鼠，观察时间7周 阅读提示：STAR★Methods，Animal model；Figure 1A |
| 体外增殖实验 | 细胞系HEPG2和HUH7，接种5000细胞至96孔板，检测时间点4h、24h、48h、72h 阅读提示：STAR★Methods，Cell proliferation assay；Figure 4 |
| 体外侵袭实验 | 细胞系HEPG2和HUH7，transwell小室，24小时（过表达）或48小时（siRNA）检测 阅读提示：STAR★Methods，Migration assay；Figure 4和5 |
| siRNA转染 | siRNA浓度和转染试剂用量（6 μL siRNA，8 μL Lipo8000），转染后5小时更换培养基 阅读提示：STAR★Methods，siRNA transfection |
| 免疫组化 | 抗体MYADML2（bs-19119R，1:400），组织样本数80例 阅读提示：STAR★Methods，Immunohistochemistry；Figure 6 |