家系突变鉴定
在SPD家系中寻找致病基因突变
对家系中28名成员（15例患者，13例正常）进行全外显子测序和Sanger测序，鉴定出HOXD13新错义突变c.G917T (p.R306L)。
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一个新的Hoxd13突变导致并指多指畸形并通过调节pSmad5/p65/c-Fos/Rank轴促进破骨细胞分化
A novel Hoxd13 mutation causes synpolydactyly and promotes osteoclast differentiation by regulating pSmad5/p65/c-Fos/Rank axis.
实验完整度
高包含家系突变鉴定、转基因小鼠模型、细胞分化实验、Western blot、Co-IP、ChIP及体内micro-CT和免疫组化等多个独立证据层级，并进行了功能验证和机制验证。
主要模型
携带Hoxd13突变的转基因小鼠 骨髓单核细胞（BMMs） 中国SPD家系患者样本
重点核对
Hoxd13突变基因型（纯合/杂合）确认 BMMs分离培养条件（M-CSF和RANKL浓度及处理时间） pSmad5抑制剂dorsomorphin的使用剂量（1200 nM） 破骨细胞分化检测（TRAP染色）及骨参数（BV/TV等） ChIP实验验证p65和c-Fos与Rank启动子结合
摘要
HOXD13基因的突变与并指多指畸形（SPD）有关，Hoxd13基因的多聚丙氨酸延伸突变可导致小鼠SPD。在本研究中，在一个中国SPD家系中鉴定出一个新的Hoxd13错义突变（NM_000523：exon2：c.G917T：p.R306L）。构建了携带相应Hoxd13突变的小鼠。结果显示，Hoxd13纯合突变也导致SPD，但杂合突变不影响肢体发育，这与SPD患者不同。随着世代增加，Hoxd13纯合突变小鼠表现出更严重的并指畸形。Western blotting显示该突变不影响Hoxd13蛋白表达，表明该突变未导致单倍剂量不足。进一步分析表明，该Hoxd13纯合突变促进破骨细胞分化和骨丢失，并增强破骨细胞相关基因Rank、c-Fos和p65的mRNA和蛋白表达。同时，该Hoxd13纯合突变升高了磷酸化Smad5（pSmad5）的水平。免疫共沉淀验证了该突变减弱了pSmad5与HOXD13之间的相互作用，表明该突变释放了更多的pSmad5。抑制pSmad5降低了Rank、c-Fos和p65的表达，即使在突变组中也是如此。此外，抑制pSmad5抑制了破骨细胞分化。ChIP实验证实p65和c-Fos可以与Rank的启动子结合。这些结果表明，该新型Hoxd13突变通过调节Smad5/p65/c-Fos/Rank轴促进破骨细胞分化，这可能为SPD的发展提供新的见解。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 新发现的HOXD13错义突变（p.R306L）如何导致并指多指畸形（SPD），其分子机制是什么？
- 核心机制
- Hoxd13突变减弱与pSmad5的相互作用，释放更多pSmad5，进而上调p65和c-Fos表达，增强p65和c-Fos与Rank启动子的结合，促进Rank转录，最终促进破骨细胞分化。
- 主要证据
- 家系全外显子测序鉴定突变；转基因小鼠显示纯合突变导致SPD和骨丢失；BMMs破骨细胞分化增强；Western blot显示pSmad5、p65、c-Fos、Rank表达上调；Co-IP显示HOXD13与pSmad5结合减弱；ChIP证实p65和c-Fos结合Rank启动子。
- 研究意义
- 该研究首次将SPD与破骨细胞分化联系起来，为SPD的发病机制提供了新见解。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
构建突变小鼠模型
验证该突变在体内的致病性
利用CRISPR/Cas9技术构建携带对应Hoxd13突变（G905T）的转基因小鼠，通过PCR和测序鉴定基因型，观察不同代际小鼠肢体表型。
体外破骨细胞分化实验
检测Hoxd13突变对破骨细胞分化的影响
分离野生型和突变型小鼠的骨髓单核细胞（BMMs），用M-CSF和RANKL诱导破骨细胞分化，TRAP染色评估分化程度。
分子表达分析
检测突变对破骨细胞相关基因和蛋白表达的影响
采用Western blot和RT-qPCR检测HOXD13、Rank、c-Fos、p65、Smad5、pSmad5等的表达水平。
机制研究
探讨突变影响Rank表达的分子机制
Co-IP检测HOXD13与pSmad5的相互作用；使用dorsomorphin抑制Smad5磷酸化，观察下游分子变化；ChIP检测p65和c-Fos与Rank启动子的结合。
体内骨表型分析
验证突变对骨量和破骨细胞的影响
对小鼠后肢进行micro-CT扫描和TRAP染色，分析骨参数（BV/TV等）和破骨细胞数量，免疫组化检测骨组织中相关蛋白表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| Western blot | 抗HOXD13抗体 | Proteintech | 18736-1-AP |
| 抗GAPDH抗体 | Proteintech | 10494-1-AP | |
| 抗β-肌动蛋白抗体 | Proteintech | 20536-1-AP | |
| 抗SMAD5抗体 | Proteintech | 12167-1-AP | |
| 抗NF-κB p65抗体 | Proteintech | 10745-1-AP | |
| 抗磷酸化SMAD5抗体 | Cell Signaling Technology | 13820 | |
| 抗c-Fos抗体 | ABclonal | A0236 | |
| 抗TNFRSF11A抗体 | ABclonal | A12997 | |
| 抗c-Fos抗体 | ABMART | TA0132S | |
| 免疫沉淀 | 抗IgG抗体 | BIOSS | bs-0295PC |
| 细胞培养 | 巨噬细胞集落刺激因子 | R&D System | 416-ML-010/CF |
| 核因子κB受体活化因子配体 | R&D System | 462-TEC-010/CF | |
| ChIP | 染色质免疫沉淀试剂盒 | Abcam | ab500 |
| 免疫共沉淀 | 免疫共沉淀试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | 26149 |
| TRAP染色 | TRAP染色试剂盒 | Sigma-Aldrich | 387A |
| 细胞培养 | α-MEM培养基 | Gibco Life Technologies | -- |
| 胎牛血清 | Gibco Life Technologies | -- | |
| Western blot | RIPA裂解液 | -- | -- |
| RT-qPCR | Trizol试剂 | -- | -- |
| HiScript II Q RT Supermix for qPCR (+gRNA Wiper) 试剂盒 | -- | -- | |
| 显微成像 | 奥林巴斯显微镜（IX53） | Olympus | IX53 |
| micro-CT | 显微CT扫描仪 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 家系突变鉴定 | 家系成员数量、测序方法（全外显子测序和Sanger测序）、突变位点（c.G917T, p.R306L） 阅读提示：Results第一部分和Fig.1 |
| 突变小鼠构建 | CRISPR/Cas9技术参数、gRNA序列、供体载体序列、小鼠遗传背景及饲养条件 阅读提示：Materials and methods中的Construction of mutant mice |
| 骨髓单核细胞分离与分化 | 小鼠周龄（8周）、每组至少3只、分离步骤、M-CSF（25 ng/ml）和RANKL（40 ng/ml）浓度、处理时间（48小时和7天） 阅读提示：Materials and methods中的Isolation and differentiation of bone marrow monocyte |
| TRAP染色 | 细胞固定（4%多聚甲醛30分钟）、染色液A和B处理时间（各30分钟）、显微镜型号 阅读提示：Materials and methods中的TRAP staining |
| Western blot | 抗体列表、稀释比例、蛋白提取方法（RIPA裂解液）、电泳条件（10% SDS-PAGE）、封闭条件（5%脱脂牛奶2小时） 阅读提示：Materials and methods中的Western blot analysis |
| RT-qPCR | 引物序列、RNA提取（Trizol）、逆转录试剂盒、内参基因（Gapdh） 阅读提示：Materials and methods中的Quantitative real-time PCR analysis |
| Co-IP | 细胞裂解液、离心条件、使用的Co-IP试剂盒 阅读提示：Materials and methods中的Co-Immunoprecipitation |
| ChIP | ChIP试剂盒（ab500）、超声破碎条件、抗体、引物序列 阅读提示：Materials and methods中的Chromatin immunoprecipitation |
| micro-CT分析 | 小鼠周龄（8周）、每组三只、麻醉方式（异氟烷）、扫描参数（未明确说明） 阅读提示：Materials and methods中的Microcomputed tomography (μCT) |
| 免疫组化 | 样本固定（4%多聚甲醛2天）、脱钙（10% EDTA，1个月）、切片和染色步骤 阅读提示：Materials and methods中的Immunohistochemistry |