建立椎间盘退变大鼠模型
在动物水平模拟椎间盘退变,为评价FMT的治疗效果提供体内模型。
使用2月龄雄性SD大鼠,通过针刺尾椎(Co7-8和Co8-9)建立IDD模型,术后第二天起每日灌胃粪菌液或生理盐水,持续14天,2个月后取材。
The Effect of Gut Microbiota on the Progression of Intervertebral Disc Degeneration.
包含动物模型(SD大鼠椎间盘针刺)、FMT干预、组织病理学(HE、S-O)、分子检测(ELISA、IHC、qRT-PCR、Western blot)及16S rRNA测序,但未进行细胞或类器官体外验证,也未探索具体菌群成分。
SD大鼠椎间盘退变模型(2月龄雄性,尾椎针刺) 粪菌移植(FMT)处理的大鼠模型
大鼠周龄、性别和来源(2月龄雄性SD大鼠,购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司) 椎间盘退变模型建立方式(20G针穿刺尾椎Co7-8和Co8-9,旋转5秒,保持30秒) FMT给药方案(粪菌液5 mL/kg灌胃,每日一次,持续14天) 检测时间点(术后2个月收集样本) 分组(对照组、IDD组、IDD+FMT组)
提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
在动物水平模拟椎间盘退变,为评价FMT的治疗效果提供体内模型。
使用2月龄雄性SD大鼠,通过针刺尾椎(Co7-8和Co8-9)建立IDD模型,术后第二天起每日灌胃粪菌液或生理盐水,持续14天,2个月后取材。
评估FMT对椎间盘组织损伤的影响。
通过HE染色和S-O染色观察椎间盘组织的病理变化,包括细胞排列、数量及蛋白多糖含量。
检测FMT对IDD大鼠血清及椎间盘组织中炎症因子表达的影响。
采用ELISA检测血清中TNF-α、IL-1β、IL-6水平;qRT-PCR和Western blot检测椎间盘组织中相关因子的mRNA和蛋白表达。
评价FMT对椎间盘组织ECM合成与降解平衡的影响。
通过qRT-PCR、Western blot和ELISA检测椎间盘组织中MMP-3、MMP-13、胶原蛋白II和聚集蛋白聚糖的表达。
探讨FMT对椎间盘组织细胞焦亡的影响。
通过qRT-PCR、Western blot和免疫组化检测椎间盘组织中NLRP3和Caspase-1的表达。
评估FMT对IDD大鼠肠道微生物群多样性和组成的影响。
收集大鼠粪便,提取DNA,进行16S rRNA基因测序,分析菌群多样性、丰度及组间差异。
按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| ELISA | TNF-α ELISA试剂盒 | Bio-Techne | RTA00 |
| IL-1β ELISA试剂盒 | Bio-Techne | RLB00 | |
| IL-6 ELISA试剂盒 | BioLegend | 437107 | |
| MMP-3 ELISA试剂盒 | Cloud-Clone Corp | SEA101Ra | |
| MMP-13 ELISA试剂盒 | Cloud-Clone Corp | SEA099Ra | |
| 胶原蛋白II ELISA试剂盒 | Wuhan Fine Biotech | ER0852 | |
| 聚集蛋白聚糖ELISA试剂盒 | Cloud-Clone Corp | SEB908Ra | |
| 免疫组化 | NLRP3一抗 | Cell Signaling Technology | PA5-79740 |
| Caspase-1一抗 | Proteintech | 22915-1-AP | |
| MMP-3一抗 | Proteintech | 17873-1-AP | |
| 胶原蛋白II一抗 | Bioss | bs-10589R | |
| 显微镜(BA410T) | Motic | BA410T | |
| 16S rRNA基因测序 | 基因组DNA提取试剂盒 | Tiangen | dp328-02 |
| 融合酶 | APExBIO | K1031 | |
| Illumina Novaseq6000测序平台 | -- | -- | |
| qRT-PCR | TRIzol试剂 | Invitrogen | 15596-026 |
| mRNA逆转录试剂盒 | Kangwei Century | CW2569 | |
| 荧光定量PCR仪 | Thermo Fisher | PIKOREAL96 | |
| Western blot | RIPA裂解液 | Abiowell | AWB0136 |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Abcam | ab102536 | |
| 化学发光成像系统 | Clinx | ChemiScope6100 | |
| TNF-α抗体 | Proteintech | 60291-1-Ig | |
| IL-1β抗体 | Abcam | ab254360 | |
| IL-6抗体 | Proteintech | 21865-1-AP | |
| MMP-3抗体 | Proteintech | 17873-1-AP | |
| MMP-13抗体 | Proteintech | 18165-1-AP | |
| 胶原蛋白II抗体 | Abcam | ab188570 | |
| 聚集蛋白聚糖抗体 | Abcam | ab36861 | |
| NLRP3抗体 | Abcam | ab263899 | |
| Caspase-1抗体 | Abcam | ab179515 | |
| β-肌动蛋白抗体 | Proteintech | 66009-1-Ig | |
| HRP标记的山羊抗兔IgG | Proteintech | SA00001-2 | |
| HRP标记的山羊抗小鼠IgG | Proteintech | SA00001-1 | |
| 统计 | GraphPad Prism软件 | GraphPad Software | -- |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物模型建立 | SD大鼠的性别、年龄、品系;麻醉剂剂量(2%戊巴比妥40 mg/kg);穿刺部位(尾椎Co7-8和Co8-9)、针号(20G)、穿刺操作(旋转5秒,保持30秒)。 阅读提示:详见Methods部分“Animals Model” |
| FMT干预 | 粪菌液的制备(10g粪便+50mL生理盐水,过滤后悬浮至100mL);给药剂量(5 mL/kg)、给药频率(每日一次)、持续时间(14天)、给药方式(灌胃)。 阅读提示:详见Methods部分“Animals Model” |
| 炎症因子检测 | ELISA检测血清和椎间盘组织中的TNF-α、IL-1β、IL-6;qRT-PCR和Western blot检测椎间盘组织中的相应因子,需要引物序列和抗体信息。 阅读提示:详见Methods部分“Enzyme-Linked Immunosorbent Assay”、“Quantitative Real-Time Polymerase Chain Reaction”、“Western Blot”及表1、表2 |
| 细胞外基质检测 | 检测MMP-3、MMP-13、胶原蛋白II和聚集蛋白聚糖的表达水平,方法同炎症因子检测。 阅读提示:详见Methods部分“Enzyme-Linked Immunosorbent Assay”、“Quantitative Real-Time Polymerase Chain Reaction”、“Western Blot”及结果部分图3 |
| 焦亡因子检测 | 检测NLRP3和Caspase-1的表达,方法包括qRT-PCR、Western blot和IHC。 阅读提示:详见Methods部分“Immunohistochemical”、“Quantitative Real-Time Polymerase Chain Reaction”、“Western Blot”及结果部分图4 |
| 肠道菌群分析 | 粪便样本收集时间(术后2个月);DNA提取试剂盒;PCR引物(V3-V4区域);测序平台(Illumina Novaseq6000);分析流程(Qiime2、DADA2、silvA-132-99数据库)。 阅读提示:详见Methods部分“16S rRNA Gene Sequencing” |