肠道微生物群对椎间盘退变进展的影响

The Effect of Gut Microbiota on the Progression of Intervertebral Disc Degeneration.

作者信息Bo Yao, Youquan Cai, Weiguo Wang, Jia Deng, Lei Zhao, Ziwei Han, Li Wan
PMID36600636
发布时间2023-03
DOI10.1111/os.13626

实验完整度

包含动物模型(SD大鼠椎间盘针刺)、FMT干预、组织病理学(HE、S-O)、分子检测(ELISA、IHC、qRT-PCR、Western blot)及16S rRNA测序,但未进行细胞或类器官体外验证,也未探索具体菌群成分。

主要模型

SD大鼠椎间盘退变模型(2月龄雄性,尾椎针刺) 粪菌移植(FMT)处理的大鼠模型

重点核对

大鼠周龄、性别和来源(2月龄雄性SD大鼠,购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司) 椎间盘退变模型建立方式(20G针穿刺尾椎Co7-8和Co8-9,旋转5秒,保持30秒) FMT给药方案(粪菌液5 mL/kg灌胃,每日一次,持续14天) 检测时间点(术后2个月收集样本) 分组(对照组、IDD组、IDD+FMT组)

摘要

目的:椎间盘退变是背痛的主要原因,其治疗造成严重的社会经济负担。粪菌移植的安全性和治疗作用已被证实。然而,粪菌移植与椎间盘退变之间的关系仍不明确。我们旨在探讨粪菌移植是否在椎间盘退变中发挥作用,以期为椎间盘退变的治疗提供参考。方法:使用2月龄雄性Sprague-Dawley大鼠建立椎间盘退变实验模型。通过灌胃给予椎间盘退变大鼠粪菌液进行粪菌移植。术后2个月收集大鼠血清、粪便和椎间盘组织。采用酶联免疫吸附试验、免疫组织化学、实时定量聚合酶链反应或蛋白质印迹法检测血清或椎间盘组织中TNF-α、IL-1β、IL-6、基质金属蛋白酶3、基质金属蛋白酶13、胶原蛋白II和聚集蛋白聚糖的水平。我们还使用苏木精和伊红以及番红O-固绿染色检查了椎间盘组织的病理学。最后,我们使用16S rRNA基因测序检测了大鼠粪便中的肠道微生物群。结果:我们发现,在椎间盘退变组大鼠中,TNF-α、IL-1β、IL-6、MMP-3、MMP-13、NLRP3和Caspase-1的表达升高。相反,胶原蛋白II和聚集蛋白聚糖的水平下调。此外,椎间盘退变组椎间盘组织严重受损,细胞排列紊乱,番红染色不均。粪菌移植逆转了椎间盘退变建模对这些因素的影响,并减轻了软骨组织损伤。此外,粪菌移植增加了椎间盘退变治疗大鼠的肠道微生物群多样性和微生物丰度。结论:我们的研究结果表明,粪菌移植在维持椎间盘细胞稳定性和减轻组织病理学损伤方面具有积极作用。它影响椎间盘退变大鼠肠道微生物群的多样性和丰度。因此,粪菌移植可能作为改善椎间盘退变的一个有前景的靶点。

实验结论

提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。

研究问题
粪菌移植(FMT)是否对椎间盘退变(IDD)具有治疗作用,以及其可能的作用机制是什么?
核心机制
FMT通过下调炎症因子(TNF-α、IL-1β、IL-6)和焦亡因子(NLRP3、Caspase-1),降低基质金属蛋白酶(MMP-3、MMP-13)水平,上调细胞外基质(胶原蛋白II和聚集蛋白聚糖)的表达,从而维持椎间盘细胞稳定,减轻组织病理损伤,并调节肠道菌群多样性及丰度。
主要证据
在IDD大鼠模型中,FMT显著抑制了炎症因子、MMP和焦亡因子的表达,并上调了细胞外基质水平,同时改善了椎间盘组织病理损伤(通过HE和S-O染色观察),并通过16S rRNA测序显示FMT增加了肠道菌群多样性和微生物丰度。
研究意义
FMT可能作为改善IDD和姑息治疗的一个有前景的靶点,为IDD的治疗提供新的干预策略。

研究路径

按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

1

建立椎间盘退变大鼠模型

在动物水平模拟椎间盘退变,为评价FMT的治疗效果提供体内模型。

使用2月龄雄性SD大鼠,通过针刺尾椎(Co7-8和Co8-9)建立IDD模型,术后第二天起每日灌胃粪菌液或生理盐水,持续14天,2个月后取材。

2

组织病理学分析

评估FMT对椎间盘组织损伤的影响。

通过HE染色和S-O染色观察椎间盘组织的病理变化,包括细胞排列、数量及蛋白多糖含量。

3

检测炎症因子水平

检测FMT对IDD大鼠血清及椎间盘组织中炎症因子表达的影响。

采用ELISA检测血清中TNF-α、IL-1β、IL-6水平;qRT-PCR和Western blot检测椎间盘组织中相关因子的mRNA和蛋白表达。

4

检测细胞外基质代谢相关分子

评价FMT对椎间盘组织ECM合成与降解平衡的影响。

通过qRT-PCR、Western blot和ELISA检测椎间盘组织中MMP-3、MMP-13、胶原蛋白II和聚集蛋白聚糖的表达。

5

检测焦亡因子表达

探讨FMT对椎间盘组织细胞焦亡的影响。

通过qRT-PCR、Western blot和免疫组化检测椎间盘组织中NLRP3和Caspase-1的表达。

6

肠道菌群分析

评估FMT对IDD大鼠肠道微生物群多样性和组成的影响。

收集大鼠粪便,提取DNA,进行16S rRNA基因测序,分析菌群多样性、丰度及组间差异。

研究方法

按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。

产品清单

实验环节名称品牌货号
TNF-α ELISA试剂盒Bio-TechneRTA00
IL-1β ELISA试剂盒Bio-TechneRLB00
IL-6 ELISA试剂盒BioLegend437107
MMP-3 ELISA试剂盒Cloud-Clone CorpSEA101Ra
MMP-13 ELISA试剂盒Cloud-Clone CorpSEA099Ra
胶原蛋白II ELISA试剂盒Wuhan Fine BiotechER0852
聚集蛋白聚糖ELISA试剂盒Cloud-Clone CorpSEB908Ra
NLRP3一抗Cell Signaling TechnologyPA5-79740
Caspase-1一抗Proteintech22915-1-AP
MMP-3一抗Proteintech17873-1-AP
胶原蛋白II一抗Biossbs-10589R
显微镜(BA410T)MoticBA410T
基因组DNA提取试剂盒Tiangendp328-02
融合酶APExBIOK1031
Illumina Novaseq6000测序平台----
TRIzol试剂Invitrogen15596-026
mRNA逆转录试剂盒Kangwei CenturyCW2569
荧光定量PCR仪Thermo FisherPIKOREAL96
RIPA裂解液AbiowellAWB0136
BCA蛋白定量试剂盒Abcamab102536
化学发光成像系统ClinxChemiScope6100
TNF-α抗体Proteintech60291-1-Ig
IL-1β抗体Abcamab254360
IL-6抗体Proteintech21865-1-AP
MMP-3抗体Proteintech17873-1-AP
MMP-13抗体Proteintech18165-1-AP
胶原蛋白II抗体Abcamab188570
聚集蛋白聚糖抗体Abcamab36861
NLRP3抗体Abcamab263899
Caspase-1抗体Abcamab179515
β-肌动蛋白抗体Proteintech66009-1-Ig
HRP标记的山羊抗兔IgGProteintechSA00001-2
HRP标记的山羊抗小鼠IgGProteintechSA00001-1
GraphPad Prism软件GraphPad Software--

关键环节

汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

环节核对要点
动物模型建立
SD大鼠的性别、年龄、品系;麻醉剂剂量(2%戊巴比妥40 mg/kg);穿刺部位(尾椎Co7-8和Co8-9)、针号(20G)、穿刺操作(旋转5秒,保持30秒)。
阅读提示:详见Methods部分“Animals Model”
FMT干预
粪菌液的制备(10g粪便+50mL生理盐水,过滤后悬浮至100mL);给药剂量(5 mL/kg)、给药频率(每日一次)、持续时间(14天)、给药方式(灌胃)。
阅读提示:详见Methods部分“Animals Model”
炎症因子检测
ELISA检测血清和椎间盘组织中的TNF-α、IL-1β、IL-6;qRT-PCR和Western blot检测椎间盘组织中的相应因子,需要引物序列和抗体信息。
阅读提示:详见Methods部分“Enzyme-Linked Immunosorbent Assay”、“Quantitative Real-Time Polymerase Chain Reaction”、“Western Blot”及表1、表2
细胞外基质检测
检测MMP-3、MMP-13、胶原蛋白II和聚集蛋白聚糖的表达水平,方法同炎症因子检测。
阅读提示:详见Methods部分“Enzyme-Linked Immunosorbent Assay”、“Quantitative Real-Time Polymerase Chain Reaction”、“Western Blot”及结果部分图3
焦亡因子检测
检测NLRP3和Caspase-1的表达,方法包括qRT-PCR、Western blot和IHC。
阅读提示:详见Methods部分“Immunohistochemical”、“Quantitative Real-Time Polymerase Chain Reaction”、“Western Blot”及结果部分图4
肠道菌群分析
粪便样本收集时间(术后2个月);DNA提取试剂盒;PCR引物(V3-V4区域);测序平台(Illumina Novaseq6000);分析流程(Qiime2、DADA2、silvA-132-99数据库)。
阅读提示:详见Methods部分“16S rRNA Gene Sequencing”