验证S100A9在HER2阳性乳腺癌中的表达
确定S100A9在HER2阳性乳腺癌中是否异常表达
使用TCGA数据库分析、RT-qPCR、IHC和Western blot检测不同亚型乳腺癌组织中的S100A9表达。
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S100A9促进HER2阳性乳腺癌糖酵解活性以诱导肿瘤微环境中的免疫抑制
S100A9 promotes glycolytic activity in HER2-positive breast cancer to induce immunosuppression in the tumour microenvironment.
实验完整度
高包含临床样本分析、细胞系体外实验和生物信息学分析等多个证据层级，并进行了功能验证和机制验证。
主要模型
HER2阳性乳腺癌患者组织样本 SK-BR-3细胞系 BT474细胞系
重点核对
HER2阳性乳腺癌患者样本量667例 S100A9 siRNA转染细胞系（SK-BR-3和BT474） 糖酵解相关酶（PGK1、LDHA、ENO1）蛋白表达 乳酸产生和葡萄糖摄取检测 细胞外酸化率（ECAR）检测
摘要
目的：本研究旨在探讨S100钙结合蛋白A9（S100A9）、肿瘤糖酵解和肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）在人表皮生长因子受体2（HER2）阳性乳腺癌（BRCA）中的相关性。材料和方法：本研究共纳入中南大学湘雅医院的667例BRCA患者。使用苏木精和伊红（H&E）染色计数组织中的TIL。人乳腺癌细胞系（SK-BR-3细胞和BT474细胞）用S100A9特异性小干扰RNA（siRNA）转染。通过免疫组织化学（IHC）染色、Western blot和免疫荧光检测S100A9、糖酵解酶和淋巴细胞标志物的表达。检测乳酸产生、葡萄糖消耗和细胞外酸化率（ECAR）以评估糖酵解活性。结果：S100A9在HER2+病例中显著过表达。在S100A9高表达组织中，磷酸甘油酸激酶1（PGK1）、乳酸脱氢酶A（LDHA）和烯醇化酶α（ENO1）的表达显著上调。在S100A9沉默的细胞系中检测到的PGK1、LDHA和ENO1的表达显著下调。此外，S100A9沉默显著改变了HER2+细胞系中的乳酸产生、葡萄糖摄取和ECAR水平。在HER2+组织中检测到S100A9和c-Myc的共表达。S100A9的缺失大大阻碍了细胞系中β-catenin的表达，随后诱导了c-Myc的磷酸化。S100A9和LDHA高表达病例中的TIL数量远高于S100A9低表达和LDHA表达较差的病例。TIL缺乏和S100A9强度升高是影响HER2+ BRCA病例生存率的因素。结论：S100A9过表达通过c-Myc相关通路上调肿瘤细胞的糖酵解活性，抑制肿瘤基质中的淋巴细胞浸润，影响免疫调节疗效和患者的长期生存。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- S100A9在HER2阳性乳腺癌中是否通过调节糖酵解影响肿瘤浸润淋巴细胞和预后？
- 核心机制
- S100A9通过β-catenin/c-Myc信号通路上调糖酵解酶（PGK1、LDHA、ENO1）表达，促进糖酵解，导致乳酸积累，从而抑制淋巴细胞浸润。
- 主要证据
- 细胞系中S100A9沉默导致糖酵解酶表达下降、乳酸和葡萄糖摄取减少，以及β-catenin/c-Myc通路抑制和c-Myc磷酸化；组织样本中S100A9高表达与TIL减少和不良生存相关。
- 研究意义
- S100A9可能作为HER2阳性乳腺癌的预后标志物和免疫治疗靶点，为免疫调节和代谢治疗提供潜在方向。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
检测S100A9对糖酵解相关酶表达的影响
评估S100A9是否调控糖酵解酶的表达
在SK-BR-3和BT474细胞中沉默S100A9，通过Western blot检测PGK1、LDHA和ENO1的表达；在HER2阳性组织中通过IHC检测这些酶的表达。
评估S100A9对糖酵解活性的影响
验证S100A9是否影响功能性糖酵解活性
检测S100A9沉默细胞中的乳酸产生、葡萄糖摄取和ECAR。
探索S100A9调控糖酵解的分子机制
探究S100A9是否通过c-Myc相关通路调控糖酵解
在S100A9沉默细胞中检测β-catenin、c-Myc和磷酸化c-Myc的表达，并通过免疫荧光观察c-Myc定位；在组织中检测S100A9和c-Myc共表达。
分析S100A9与肿瘤浸润淋巴细胞的关系
评估S100A9和LDHA表达与TIL浸润及亚型的关系
在HER2阳性乳腺癌组织中通过H&E和IHC评估总TIL及CD3、CD4、CD8、FOXP3阳性细胞的比例，并根据S100A9和LDHA表达水平分组比较。
评估S100A9对预后的影响
探究S100A9表达是否与HER2阳性乳腺癌患者生存相关
使用KM plotter数据库和临床随访数据进行生存分析，评估S100A9表达对不同亚型乳腺癌预后的影响。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 1640培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 青霉素 | -- | -- | |
| 链霉素 | -- | -- | |
| siRNA转染 | S100A9小干扰RNA | Sangon Biotech | -- |
| Opti-MEM培养基 | Gibco | 31985-070 | |
| Lipofectamine 3000转染试剂 | Invitrogen | L3000-015 | |
| RT-qPCR | 总RNA提取试剂盒 | Solarbio | -- |
| 逆转录试剂盒 | Yeasen | -- | |
| Hieff qPCR SYBR Green预混液 | -- | -- | |
| 组织包埋切片 | 最佳切割温度化合物 | -- | -- |
| 免疫组化 | S100A9抗体 | BIOSS | bs-2697R |
| LDHA抗体 | Affinity | DF6280 | |
| PGK1抗体 | Affinity | DF6722 | |
| ENO1抗体 | Affinity | DF6191 | |
| β-catenin抗体 | Affinity | AF6266 | |
| c-Myc抗体 | Affinity | AF0358 | |
| CD3抗体 | BIOSS | bs-0765R | |
| CD4抗体 | BIOSS | bs-0647R | |
| CD8抗体 | BIOSS | bs-4790R | |
| FOXP3抗体 | BIOSS | bs-0269R | |
| HRP标记二抗 | BIOSS | bs-0295G-HRP | |
| Western blot | PVDF膜 | -- | -- |
| 增强化学发光试剂 | Beyotime | P0018S-2 | |
| 自动化学发光图像分析系统 | Tanon | 5200 | |
| 免疫荧光 | Triton X-100 | BIOSS | P0096 |
| 磷酸盐缓冲液 | Solarbio | P1022 | |
| 牛血清白蛋白 | BIOSS | bs-0292P | |
| DAPI | BIOSS | C02-04002 | |
| 抗淬灭封片剂 | Solarbio | S2110 | |
| 糖代谢检测 | 葡萄糖摄取检测试剂盒 | BioVision/Abcam | ab136955 |
| 乳酸检测试剂盒 | BioVision/Abcam | ab83429 | |
| 细胞外酸化率检测 | Seahorse XFe 96细胞外通量分析仪 | Agilent Technologies | -- |
| Seahorse XF 96细胞培养微孔板 | -- | -- | |
| Seahorse XF校准液 | -- | -- | |
| 糖酵解压力测试试剂盒 | -- | -- | |
| 显微镜观察 | OLYMPUS DP26光学显微镜 | OLYMPUS | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 患者纳入 | HER2阳性乳腺癌诊断标准（IHC 3+或FISH阳性），排除标准，样本量667例，治疗和随访信息 阅读提示：Materials and methods: Study participants, Table 1 |
| 细胞培养与S100A9沉默 | 细胞系SK-BR-3和BT474的来源，培养基成分（1640+10%FBS+双抗），培养条件（37°C，5%CO2），siRNA序列和转染试剂，转染时间24小时 阅读提示：Materials and methods: Cell culture and treatment, Small interference RNA transfection |
| Western blot | 抗体稀释比例（1:1000），蛋白上样量，电泳条件（10% SDS-PAGE），转膜条件（200mA，90分钟），封闭时间（2h），一抗孵育（4°C过夜），二抗孵育（2h），曝光时间（20分钟） 阅读提示：Materials and methods: Western blot analysis |
| 免疫组化 | 抗体稀释比例（1:300），抗原修复条件，DAB显色，评分标准（比例×强度） 阅读提示：Materials and methods: Immunohistochemical staining |
| 糖代谢功能检测 | 葡萄糖饥饿时间（12小时），2-DG浓度和孵育时间（20分钟），乳酸检测波长（450nm），ECAR检测细胞密度（1×10^4 cells/well） 阅读提示：Materials and methods: Detection of glucose consumption and lactate production, Detection of the extracellular acidification rate |
| 统计分析 | 统计检验（t检验，ROC曲线，Kaplan-Meier，Cox回归），软件版本（GraphPad Prism 8.0, SPSS 25.0, R 4.0.4），显著性水平（p<0.05） 阅读提示：Materials and methods: Statistical analyses |