circRNA鉴定与表达分析
鉴定绵羊骨骼肌不同发育阶段的circRNAs并分析其动态表达。
使用RNA-seq对F90、L30、A3Y三个时期的背最长肌进行测序，鉴定circRNAs，并通过qPCR和RNase R处理验证circRNA表达和环状特性。
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环状RNAs的全基因组分析揭示circCHRNG通过miR-133/SRF和MEF2A轴调控绵羊成肌细胞增殖
Genome-Wide Analysis of Circular RNAs Reveals circCHRNG Regulates Sheep Myoblast Proliferation via miR-133/SRF and MEF2A Axis.
实验完整度
高包含RNA-seq转录组分析、RT-qPCR验证、细胞功能实验（MTT、Western blot）以及双荧光素酶报告基因机制验证，证据层级多样。
主要模型
绵羊骨骼肌卫星细胞（SMSCs） 293T细胞 绵羊背最长肌组织（F90、L30、A3Y）
重点核对
circCHRNG的敲低效率（siRNA转染） circCHRNG与miR-133的结合位点验证（双荧光素酶报告基因） miR-133对SMSCs增殖的影响（miR-133 mimics/inhibitor） 共转染si-circCHRNG和miR-133 inhibitor对细胞增殖和PAX7表达的回复效应
摘要
作为非编码RNA家族中相对较新的成员，circRNAs在多种生物过程中发挥重要作用。然而，circRNAs在绵羊骨骼肌发育过程中的时序表达模式和功能仍不清楚。本研究旨在鉴定与绵羊骨骼肌发育相关的circRNAs，并探讨它们在成肌细胞增殖中的作用。通过RNA-seq方法获得了绵羊F90、L30和A3Y背最长肌的circRNA表达谱。利用CCK-8测定、Western blot、qPCR和双荧光素酶报告基因实验探讨了新型circCHRNG在肌肉卫星细胞增殖中的功能和机制。我们鉴定了12,375个circRNAs，其中在三个比较组中分别发现476、133和233个差异表达circRNAs（DEcircRNAs）。KEGG结果显示，DEcircRNAs富集于肌肉收缩、细胞增殖调控以及AMPK、胰岛素和PI3K-Akt信号通路。值得注意的是，一种名为circRNA CHRNG的新型circRNA作为miR-133的海绵体促进骨骼肌卫星细胞增殖。我们的研究系统地描述了绵羊骨骼肌在胎儿、羔羊和成年阶段的circRNAs。GO和KEGG分析显示，DEcircRNAs富集于多个与肌肉发育相关的通路，如PI3K-Akt和AMPK信号通路。此外，我们提出circCHRNG作为miR-133的海绵体上调SRF和MEF2A的表达水平，从而促进成肌细胞增殖。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 绵羊骨骼肌发育过程中circRNAs的表达动态及其在成肌细胞增殖中的功能和机制是什么？
- 核心机制
- circCHRNG作为miR-133的海绵体，上调miR-133靶基因SRF和MEF2A的表达，从而促进成肌细胞增殖。
- 主要证据
- RNA-seq鉴定circCHRNG在肌肉发育中下调；敲低circCHRNG促进SMSCs增殖（MTT、PAX7表达）；双荧光素酶报告基因验证circCHRNG与miR-133直接结合；miR-133 inhibitor回复敲低circCHRNG的促增殖效应。
- 研究意义
- 为理解绵羊肌肉发育的分子机制提供有价值资源，为未来改善肉类生产提供候选circRNAs。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
功能富集分析
探索差异表达circRNAs的潜在生物学功能。
对DEcircRNAs进行GO和KEGG富集分析，并构建circRNA-miRNA网络。
circCHRNG功能验证
验证circCHRNG对绵羊骨骼肌卫星细胞增殖的影响。
设计siRNA敲低circCHRNG，通过MTT实验检测细胞活力，Western blot检测PAX7表达。
circCHRNG-miR-133相互作用验证
验证circCHRNG与miR-133的直接结合及其对miR-133表达的影响。
构建circCHRNG野生型和突变型双荧光素酶报告载体，共转染miR-133 mimics，检测荧光素酶活性；qPCR检测miR-133表达。
机制验证：miR-133/sponge对下游靶基因及增殖的影响
确证circCHRNG通过海绵吸附miR-133调控SRF和MEF2A表达进而影响增殖。
在SMSCs中单独敲低circCHRNG或与miR-133 inhibitor共转染，检测SRF、MEF2A、PAX7蛋白表达及细胞增殖。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| RNA提取与建库 | RNeasy Plus Universal Mini Kit | Qiagen | -- |
| RNA质量检测 | Agilent Bioanalyzer 2100 | Agilent Technologies | -- |
| RNA 6000 Nano Kit | Agilent Technologies | -- | |
| rRNA去除 | Ribo-Zero Magnetic Gold Kit | -- | -- |
| 线性RNA去除 | RNase R | Epicentre | -- |
| RNA测序 | Hiseq2500平台 | Illumina | -- |
| cDNA合成 | PrimeScript RT试剂盒（含gDNA Eraser） | Takara | -- |
| RT-qPCR | SYBR Premix Ex Taq II试剂盒 | Takara | -- |
| ABI 7500 | Applied Biosystems | -- | |
| 细胞培养 | DMEM/F12（Ham）培养基 | Gibco | -- |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 青霉素/链霉素 | -- | -- | |
| 细胞消化 | 胰蛋白酶 | Gibco | -- |
| 细胞过滤 | 70微米孔径尼龙网 | BD Falcon | -- |
| 质粒构建 | pmirGLO双荧光素酶报告载体 | Promega | -- |
| 转染 | Lipofectamine 3000试剂 | Invitrogen | -- |
| 双荧光素酶实验 | 双荧光素酶检测试剂盒 | Promega | -- |
| 细胞增殖检测 | MTT检测试剂盒 | Solarbio | -- |
| 蛋白提取 | RIPA裂解液 | -- | -- |
| 蛋白定量 | BCA蛋白定量试剂盒 | Thermo Pierce | -- |
| Western blot | PVDF膜 | Bio-Rad | -- |
| 抗β-Actin抗体 | Proteintech | 66009-1-Ig | |
| 抗Pax7抗体 | Bioss | bs-2413R | |
| 抗SRF抗体 | CST | 5147S | |
| 抗MEF2A抗体 | Bioss | bs-5485R | |
| 抗GAPDH抗体 | Proteintech | HRP-60004 | |
| 山羊抗兔二抗 | Solarbio | SE13 | |
| 山羊抗小鼠二抗 | Solarbio | SE131 | |
| Western blot显影 | 增强化学发光试剂盒 | Fdbio | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物样本收集 | 绵羊品种、饲养条件、背最长肌取样时期（F90、L30、A3Y）及样本重复数 阅读提示：见4.1节 |
| RNA-seq建库与测序 | RNA提取试剂盒、rRNA去除方法、RNase R处理、测序平台及读长 阅读提示：见4.2节 |
| circRNA鉴定 | 参考基因组版本、比对软件参数、circRNA筛选标准（junction reads数） 阅读提示：见4.3节 |
| 差异表达分析 | 差异表达阈值（log2FC、FDR） 阅读提示：见4.4节 |
| 细胞培养与转染 | SMSCs分离方法、培养条件、siRNA和miRNA mimics/inhibitor转染浓度 阅读提示：见4.7节 |
| 双荧光素酶报告实验 | 载体构建、转染剂量、检测时间及重复次数 阅读提示：见4.8节 |
| 细胞增殖测定 | MTT实验条件（细胞数量、MTT孵育时间） 阅读提示：见4.9节 |
| Western blot | 蛋白提取方法、抗体稀释比例、孵育条件 阅读提示：见4.10节 |