冷驯化布氏田鼠(Lasiopodomys brandtii)棕色脂肪组织消融诱导肌肉基因的募集

Recruitment of Muscle Genes as an Effect of Brown Adipose Tissue Ablation in Cold-Acclimated Brandt's Voles (Lasiopodomys brandtii).

作者信息Min Liu, Xue-Ying Zhang, Chen-Zhu Wang, De-Hua Wang
PMID36613791
发布时间2022-12-25
DOI10.3390/ijms24010342

实验完整度

文献包含iBAT切除手术、冷驯化模型、代谢测量、基因和蛋白表达检测、免疫组化、电镜观察等多个独立证据层级,并有功能验证。

主要模型

布氏田鼠(Lasiopodomys brandtii) iBAT切除模型 冷驯化模型

重点核对

手术切除iBAT(占总量52%~56%) 冷驯化温度4±1°C,持续28天 样本量:每组6只成年雄性布氏田鼠 mRNA和蛋白检测的基因:UCP1, PGC-1α, PPARγ, PCNA, SERCA1, SLN, RYR1, UCP3等

摘要

基于骨骼肌的非颤抖性产热(NST)在鸟类和不含有棕色脂肪组织(BAT)的大型哺乳动物的体温调节和维持中起着重要作用。然而,在进化出专性产热器官BAT的野生小型哺乳动物中,肌肉型NST对体温调节的相对贡献尚未明确。本研究探讨了当布氏田鼠(Lasiopodomys brandtii)的BAT功能被条件性最小化时,肌肉是否会成为NST的重要部位。我们手术切除了肩胛间BAT(iBAT,占总BAT的52%~56%),并将田鼠暴露于长期寒冷(4°C)28天。在整个冷驯化期间,iBAT切除的田鼠能够维持与假手术组相同的NST水平和体温(约37.9°C)。冷驯化田鼠iBAT中解偶联蛋白1(UCP1)及其转录调控因子在蛋白和mRNA水平的表达高于温暖组。然而,在BAT的其他部位(包括肩胛下区、颈部和腋窝),除PGC-1α外,这些产热相关标志物的蛋白或mRNA水平在温暖组和冷组之间没有差异,无论是在假手术组还是iBAT切除组。在冷驯化期间,iBAT切除的田鼠白色脂肪组织(WAT)中UCP1表达高于假手术组。骨骼肌中肌脂蛋白(SLN)和肌浆内质网Ca2+依赖性三磷酸腺苷酶(SERCA)的表达在寒冷组高于温暖组,但未观察到受磷蛋白(PLB)和磷酸化PLB(P-PLB)的改变。此外,在寒冷条件下,iBAT切除组的表达高于假手术组。而且,这些iBAT切除的田鼠经历了广泛的线粒体重塑和与线粒体代谢相关的关键组分基因的改变。这些数据共同表明,骨骼肌产热的募集可能补偿BAT损伤,并提示野生小型哺乳动物在应对寒冷胁迫时iBAT和骨骼肌两种产热过程之间存在功能互作。

实验结论

提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。

研究问题
当BAT功能被最小化时,布氏田鼠的骨骼肌是否成为非颤抖性产热的重要部位并补偿BAT损伤?
核心机制
冷驯化和iBAT切除上调骨骼肌中SERCA1、SLN和RyR1等Ca2+循环蛋白的表达,并增加线粒体数量和代谢基因表达,从而增强肌肉产热。
主要证据
iBAT切除的田鼠在冷驯化中维持正常体温和NST;骨骼肌中SERCA1、SLN和RyR1表达上调,线粒体数量增加;WAT褐变增强。
研究意义
研究揭示了野生小型哺乳动物中iBAT和骨骼肌产热功能的相互作用,表明骨骼肌产热可补偿BAT功能损伤,对理解物种应对寒冷胁迫的适应机制具有意义。

研究路径

按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

1

动物模型建立与分组

建立iBAT切除模型并设置温度处理组,以探究BAT功能最小化的影响。

成年雄性布氏田鼠(6月龄)单笼饲养,适应性2周后,12只行iBAT切除术,12只行假手术。分为4组:冷切除(CR)、冷假手术(CS)、暖切除(WR)、暖假手术(WS),每组6只。在4±1°C或23±1°C下驯化28天。

2

代谢表型测量

评估iBAT切除和冷驯化对体重、食物摄入、体温、RMR和NST的影响。

每三天测量体重和食物摄入;在第4周初用开放式呼吸测定系统测量RMR(30°C)和NST(25°C,注射去甲肾上腺素)。

3

BAT和WAT产热标志物检测

检测iBAT及其他部位BAT和WAT中产热相关基因和蛋白的表达,探究iBAT切除的影响。

RT-qPCR和Western blot检测iBAT、其他BAT部位(肩胛下、颈、腋窝)及WAT中UCP1、PGC-1α、PPARγ、PCNA、DIO2、TH等表达;免疫组化检测WAT褐变。

4

骨骼肌产热标志物检测

验证骨骼肌中Ca2+循环蛋白和产热相关基因在冷驯化和iBAT切除后的变化。

RT-qPCR检测SERCA1、SERCA2、SLN、PLB、RYR1、UCP3、PGC-1α等mRNA;Western blot检测SERCA1、P-PLB、PGC-1α、UCP3蛋白。

5

线粒体形态和代谢基因分析

评估iBAT切除和冷驯化对骨骼肌线粒体数量和代谢基因表达的影响。

透射电镜观察胫骨前肌线粒体超微结构;RT-qPCR检测CSY、ACACβ、COX II mRNA表达。

6

统计分析

分析各组间差异的统计学显著性。

使用SPSS 26.0进行双因素方差分析、重复测量方差分析或协方差分析,Tukey事后检验。

研究方法

按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。

产品清单

实验环节名称品牌货号
标准兔颗粒饲料北京科澳协力饲料有限公司--
可吸收PGA缝线上海金环R413
TSE labmasterTSE--
数字温度计优利德UT320
TRIzol试剂VazymeR401-01
HiScript III 第一链cDNA合成试剂盒(+gDNA去除)VazymeR312-01/02
2×Taq Pro通用SYBR qPCR预混液VazymeQ712-02
Piko Real 96Thermo Scientific--
RIPA裂解液----
蛋白酶抑制剂混合物Sigma-AldrichP8340
5×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液Yeasen--
Mini Protean电泳装置BioRad Laboratories--
辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgGYeasen33101ES60
辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgGYeasen33201ES60
化学发光底物Yeasen--
PCNA (PC10)小鼠单克隆抗体Cell Signaling Technology2586
抗UCP1抗体Abcamab10983
PPARγ (C26H12)兔单克隆抗体Cell Signaling Technology2435
兔抗PPARGC1A多克隆抗体Biossbs-1832R
DIO2多克隆抗体Cloud-Clone Corp.PAC903Ra01
抗酪氨酸羟化酶抗体Merck MilliporeAB152
ATP2A1/SERCA1 (L24)抗体Cell Signaling Technology4219
磷酸化受磷蛋白(Ser16/Thr17)抗体Cell Signaling Technology8496
β-微管蛋白小鼠单克隆抗体Yeasen30301ES40
GAPDH (克隆:1A6)小鼠单克隆抗体Yeasen30201ES20
磷酸盐缓冲液SolarbioP1003
柠檬酸抗原修复液北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司AR-5011
正常山羊血清SolarbioS9070
抗UCP1抗体Abcamab10983
生物素标记的山羊抗兔二抗Yeasen33101ES60
ABC复合物Vector LabsPK-6100
DAB显色液Vector LabsSK-4100
LR White树脂Electron Microscopy Sciences--
JEM-1400透射电子显微镜JEOL--

关键环节

汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

环节核对要点
动物模型
布氏田鼠品系来源、性别(雄性)、年龄(6月龄)、体重范围
阅读提示:Methods 4.1 Animals
iBAT切除手术
iBAT切除范围(52~56%)、麻醉剂量(30 mg/kg戊巴比妥钠)、手术步骤
阅读提示:Methods 4.2 Experimental Design, 4.3 Surgical Removal of iBAT
冷驯化
温度(4±1°C)、持续时间(28天)、光照周期(16L:8D)
阅读提示:Methods 4.2 Experimental Design
代谢测量
RMR测量温度(30°C)、NST测量温度(25°C)、NE剂量公式、气流速率
阅读提示:Methods 4.5 Metabolic Measurements
分子检测
引物序列、抗体货号、PCR条件、Western blot上样量
阅读提示:Methods 4.8 RT-qPCR, 4.9 Western Blotting
免疫组化
切片厚度(5 μm)、抗体稀释度(1:1000)、修复条件
阅读提示:Methods 4.10 Immunohistochemistry
电镜
组织固定液、切片厚度(80 nm)、染色方法
阅读提示:Methods 4.11 Transmission Electron Microscopy