动物模型建立与分组
建立iBAT切除模型并设置温度处理组,以探究BAT功能最小化的影响。
成年雄性布氏田鼠(6月龄)单笼饲养,适应性2周后,12只行iBAT切除术,12只行假手术。分为4组:冷切除(CR)、冷假手术(CS)、暖切除(WR)、暖假手术(WS),每组6只。在4±1°C或23±1°C下驯化28天。
Recruitment of Muscle Genes as an Effect of Brown Adipose Tissue Ablation in Cold-Acclimated Brandt's Voles (Lasiopodomys brandtii).
文献包含iBAT切除手术、冷驯化模型、代谢测量、基因和蛋白表达检测、免疫组化、电镜观察等多个独立证据层级,并有功能验证。
布氏田鼠(Lasiopodomys brandtii) iBAT切除模型 冷驯化模型
手术切除iBAT(占总量52%~56%) 冷驯化温度4±1°C,持续28天 样本量:每组6只成年雄性布氏田鼠 mRNA和蛋白检测的基因:UCP1, PGC-1α, PPARγ, PCNA, SERCA1, SLN, RYR1, UCP3等
提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
建立iBAT切除模型并设置温度处理组,以探究BAT功能最小化的影响。
成年雄性布氏田鼠(6月龄)单笼饲养,适应性2周后,12只行iBAT切除术,12只行假手术。分为4组:冷切除(CR)、冷假手术(CS)、暖切除(WR)、暖假手术(WS),每组6只。在4±1°C或23±1°C下驯化28天。
评估iBAT切除和冷驯化对体重、食物摄入、体温、RMR和NST的影响。
每三天测量体重和食物摄入;在第4周初用开放式呼吸测定系统测量RMR(30°C)和NST(25°C,注射去甲肾上腺素)。
检测iBAT及其他部位BAT和WAT中产热相关基因和蛋白的表达,探究iBAT切除的影响。
RT-qPCR和Western blot检测iBAT、其他BAT部位(肩胛下、颈、腋窝)及WAT中UCP1、PGC-1α、PPARγ、PCNA、DIO2、TH等表达;免疫组化检测WAT褐变。
验证骨骼肌中Ca2+循环蛋白和产热相关基因在冷驯化和iBAT切除后的变化。
RT-qPCR检测SERCA1、SERCA2、SLN、PLB、RYR1、UCP3、PGC-1α等mRNA;Western blot检测SERCA1、P-PLB、PGC-1α、UCP3蛋白。
评估iBAT切除和冷驯化对骨骼肌线粒体数量和代谢基因表达的影响。
透射电镜观察胫骨前肌线粒体超微结构;RT-qPCR检测CSY、ACACβ、COX II mRNA表达。
分析各组间差异的统计学显著性。
使用SPSS 26.0进行双因素方差分析、重复测量方差分析或协方差分析,Tukey事后检验。
按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 动物饲养 | 标准兔颗粒饲料 | 北京科澳协力饲料有限公司 | -- |
| 手术缝合 | 可吸收PGA缝线 | 上海金环 | R413 |
| 代谢测量 | TSE labmaster | TSE | -- |
| 体温测量 | 数字温度计 | 优利德 | UT320 |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Vazyme | R401-01 |
| cDNA合成 | HiScript III 第一链cDNA合成试剂盒(+gDNA去除) | Vazyme | R312-01/02 |
| qPCR | 2×Taq Pro通用SYBR qPCR预混液 | Vazyme | Q712-02 |
| Piko Real 96 | Thermo Scientific | -- | |
| Western blot | RIPA裂解液 | -- | -- |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | Sigma-Aldrich | P8340 | |
| 5×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液 | Yeasen | -- | |
| Mini Protean电泳装置 | BioRad Laboratories | -- | |
| 辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG | Yeasen | 33101ES60 | |
| 辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG | Yeasen | 33201ES60 | |
| 化学发光底物 | Yeasen | -- | |
| PCNA (PC10)小鼠单克隆抗体 | Cell Signaling Technology | 2586 | |
| 抗UCP1抗体 | Abcam | ab10983 | |
| PPARγ (C26H12)兔单克隆抗体 | Cell Signaling Technology | 2435 | |
| 兔抗PPARGC1A多克隆抗体 | Bioss | bs-1832R | |
| DIO2多克隆抗体 | Cloud-Clone Corp. | PAC903Ra01 | |
| 抗酪氨酸羟化酶抗体 | Merck Millipore | AB152 | |
| ATP2A1/SERCA1 (L24)抗体 | Cell Signaling Technology | 4219 | |
| 磷酸化受磷蛋白(Ser16/Thr17)抗体 | Cell Signaling Technology | 8496 | |
| β-微管蛋白小鼠单克隆抗体 | Yeasen | 30301ES40 | |
| GAPDH (克隆:1A6)小鼠单克隆抗体 | Yeasen | 30201ES20 | |
| 免疫组化 | 磷酸盐缓冲液 | Solarbio | P1003 |
| 柠檬酸抗原修复液 | 北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司 | AR-5011 | |
| 正常山羊血清 | Solarbio | S9070 | |
| 抗UCP1抗体 | Abcam | ab10983 | |
| 生物素标记的山羊抗兔二抗 | Yeasen | 33101ES60 | |
| ABC复合物 | Vector Labs | PK-6100 | |
| DAB显色液 | Vector Labs | SK-4100 | |
| 电镜 | LR White树脂 | Electron Microscopy Sciences | -- |
| JEM-1400透射电子显微镜 | JEOL | -- |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物模型 | 布氏田鼠品系来源、性别(雄性)、年龄(6月龄)、体重范围 阅读提示:Methods 4.1 Animals |
| iBAT切除手术 | iBAT切除范围(52~56%)、麻醉剂量(30 mg/kg戊巴比妥钠)、手术步骤 阅读提示:Methods 4.2 Experimental Design, 4.3 Surgical Removal of iBAT |
| 冷驯化 | 温度(4±1°C)、持续时间(28天)、光照周期(16L:8D) 阅读提示:Methods 4.2 Experimental Design |
| 代谢测量 | RMR测量温度(30°C)、NST测量温度(25°C)、NE剂量公式、气流速率 阅读提示:Methods 4.5 Metabolic Measurements |
| 分子检测 | 引物序列、抗体货号、PCR条件、Western blot上样量 阅读提示:Methods 4.8 RT-qPCR, 4.9 Western Blotting |
| 免疫组化 | 切片厚度(5 μm)、抗体稀释度(1:1000)、修复条件 阅读提示:Methods 4.10 Immunohistochemistry |
| 电镜 | 组织固定液、切片厚度(80 nm)、染色方法 阅读提示:Methods 4.11 Transmission Electron Microscopy |