检测内源Dvl2相分离
观察内源Dvl2是否形成液滴样凝聚体
生成Dvl2-mEGFP敲入HEK293T细胞，使用GI-SIM和FRAP分析内源Dvl2的分布和动力学。
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Dvl2相分离促进Wnt信号体的组装和破坏复合体的解体
Dishevelled phase separation promotes Wnt signalosome assembly and destruction complex disassembly.
实验完整度
高包含体外相分离实验、细胞成像（GI-SIM/TIRF）、基因编辑敲除/敲入、体内功能验证（TopFlash报告基因）等多层级证据。
主要模型
HEK293T细胞 Dvl1/2/3敲除HEK293T细胞 Dvl2-mEGFP敲入HEK293T细胞 Axin1-tdTomato敲入HEK293T细胞
重点核对
Wnt3a刺激浓度和时长 Dvl2-mEGFP或Axin1-tdTomato敲入细胞系 PEG8000浓度及相分离诱导条件 蛋白浓度（如0.2 μM Dvl2、0.5 μM Axin1） FRAP参数（荧光恢复率）
摘要
Kang等人证明Dvl2发生相分离，并在Wnt刺激下快速积累到质膜。Dvl2相分离在Wnt受体信号体的组装和β-catenin破坏复合体的解体中起关键作用。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- Wnt/β-catenin信号通路中，信号体与破坏复合体如何协调组装和拆卸？
- 核心机制
- Dvl2通过IDR1介导液-液相分离，促进信号体的组装，并通过抑制Axin1的相分离来破坏β-catenin破坏复合体。
- 主要证据
- 体外和细胞内实验表明Dvl2突变体（dRE）丧失相分离能力，导致信号体组装受损和破坏复合体解体失败，TopFlash报告基因实验证明Dvl2相分离对Wnt信号激活至关重要。
- 研究意义
- 揭示Dvl2相分离在Wnt信号协调中的关键作用，为理解Wnt信号失调相关疾病提供新视角。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体外验证Dvl2相分离
验证Dvl2是否具备液-液相分离特性
纯化MBP-Dvl2蛋白，加入PEG8000诱导相分离，观察液滴形成和融合。
鉴定Dvl2相分离关键区域
确定Dvl2中负责LLPS的氨基酸区域
构建Dvl2缺失突变体并转染Dvl1/2/3 KO细胞，观察puncta形成。
信号体组装的动态观察
实时追踪Wnt刺激下Dvl2和Axin1在质膜上的募集顺序
使用TIRF-SIM成像Dvl2-mEGFP和Axin1-tdTomato敲入细胞，记录Wnt3a处理后荧光强度变化。
验证Dvl2相分离对信号体组装的功能
确定Dvl2 LLPS是否对信号体组装必要
表达Dvl2-EGFP或Dvl2(dRE)-EGFP于KO细胞，用TIRF检测质膜puncta大小和数量。
检测Dvl2对Axin1相分离的影响
探究Dvl2是否调节Axin1的LLPS
共表达Dvl2或Dvl2(dRE)与Axin1-mCherry，观察puncta大小和数目；体外混合纯化蛋白进行LLPS实验。
评估Dvl2对破坏复合体功能的影响
验证Dvl2 LLPS是否能抑制β-catenin降解
体外磷酸化实验检测β-catenin磷酸化水平；TopFlash报告基因检测Wnt信号活性。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证细胞功能变化
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Corning | -- |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 细胞转染 | VigoFect转染试剂 | Vigorous Biotechnology | -- |
| Lipofectamine 2000转染试剂 | Invitrogen | -- | |
| 免疫印迹 | Dvl2抗体 | Cell Signaling Technology | 3216 |
| Dvl1抗体 | Santa Cruz Technology | sc-8025 | |
| Dvl3抗体 | Santa Cruz Technology | sc-8027 | |
| β-catenin抗体 | Santa Cruz Technology | SC7963 | |
| CK1α抗体 | Abcam | ab108296 | |
| GSK3β抗体 | Cell Signaling Technology | 12456 | |
| 磷酸化β-catenin (S45)抗体 | Cell Signaling Technology | 9564 | |
| 磷酸化β-catenin (S33,37,T41)抗体 | Cell Signaling Technology | 2009 | |
| Axin1抗体 | Cell Signaling Technology | 2074 | |
| Flag抗体 | Bioss Antibodies | bsm-33346M | |
| GFP抗体 | Santa Cruz Technology | scc8334 | |
| 基因编辑 | PX459质粒 | Addgene | #48139 |
| 蛋白纯化 | 直链淀粉树脂 | NEB | -- |
| HiPrep 26/60 Sephacryl S-200 HR柱 | GE Healthcare | 17-1195-01 | |
| AKTA纯化系统 | GE Healthcare | -- | |
| 荧光标记 | Alexa Fluor 488 NHS酯 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 磺基花青素3马来酰亚胺 | Lumiprobe | -- | |
| Alexa Fluor 647 NHS酯 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 脱盐柱 | Thermo Fisher Scientific | 89882 | |
| 浊度测定 | VARIOSKAN FLASH酶标仪 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 成像 | NIKON A1 HD25显微镜 | Nikon | -- |
| 多色结构光照明显微系统 | NanoInsights | -- | |
| ORCA-Fusion C14440-20UP相机 | HAMAMATSU | C14440-20UP | |
| 质谱分析 | Q-Exactive HF-X杂化四极杆-Orbitrap质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| Thermo-Dionex Ultimate 3000高效液相色谱系统 | Thermo Fisher Scientific | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养与基因编辑 | HEK293T细胞来源、培养基成分、Dvl1/2/3 KO及Dvl2-mEGFP敲入细胞系构建方法 阅读提示：Materials and methods: Cell culture, Gene editing |
| 体外相分离实验 | Dvl2蛋白浓度、盐浓度、PEG8000浓度 阅读提示：Materials and methods: In vitro phase separation assay |
| TIRF成像 | Wnt3a浓度和处理时间、成像时间间隔 阅读提示：Materials and methods: GI-SIM/TIRF-SIM imaging, Figure legends |
| FRAP分析 | 荧光标记浓度、光漂白区域和恢复率 阅读提示：Materials and methods: FRAP analysis |
| TopFlash报告基因实验 | 转染量、Wnt3a处理时间、检测时间 阅读提示：Materials and methods: Reporter assays, Figure 4E legend |