DNMT1对颗粒细胞功能的调控
验证DNMT1对颗粒细胞增殖、凋亡及E2分泌的影响
使用5-Aza-CdR抑制DNA甲基化，过表达或敲低DNMT1，检测GCs增殖、凋亡、细胞周期及E2分泌。
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DNMT1介导的lncRNA IFFD通过海绵吸附miR-370靶向GLI1调控卵泡发育
DNMT1-mediated lncRNA IFFD controls the follicular development via targeting GLI1 by sponging miR-370.
实验完整度
高包含体外细胞实验（猪颗粒细胞）、体内小鼠模型、猪卵泡体外培养，并采用RNA-seq、双荧光素酶、ChIP、BSP、功能验证等，证据层级丰富，机制验证完整。
主要模型
猪原代颗粒细胞 猪卵泡体外培养模型 小鼠卵巢体内感染模型
重点核对
猪颗粒细胞处理：0.5 μM 5-Aza-CdR处理24小时 DNMT1过表达质粒pcDNA3.1-DNMT1（500 ng）及DNMT1-siRNA1敲低 小鼠分组：LV-NC、LV-lnc IFFD、sh-NC、sh-lnc IFFD各5只，每周腹腔注射1×10^7 TU慢病毒，共3周 IFFD过表达或敲低慢病毒（LV-lnc IFFD或sh-lnc IFFD）感染猪卵泡和小鼠卵巢 关键检测：EdU、流式细胞术、ELISA、TUNEL、双荧光素酶报告基因、ChIP-qPCR、BSP
摘要
DNA甲基化和长链非编码RNA（lncRNAs）在卵泡发育中发挥不可或缺的作用。然而，DNA甲基化介导的lncRNAs在卵泡发育中的具体机制仍不清楚。本研究发现，抑制DNMT1的表达可促进颗粒细胞（GCs）凋亡从而抑制卵泡发育。一个名为卵泡发育抑制因子（IFFD）的新型卵泡发育相关lncRNA受DNMT1介导，并通过抑制GCs增殖和雌激素（E2）分泌但促进GCs凋亡来阻滞卵泡发育。机制上，失活的Cas9-TET1证明IFFD启动子−1261/−1254区域的低甲基化通过招募SP1促进IFFD的转录。IFFD通过竞争性结合miR-370诱导GLI家族锌指蛋白1的表达，从而上调CASP3的表达促进GCs凋亡，同时下调PCNA和CYP19A1的表达抑制GCs增殖和E2分泌。总之，DNMT1介导的IFFD可能是调控卵泡发育的新靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- DNA甲基化介导的lncRNA如何调控卵泡发育？具体机制是什么？
- 核心机制
- DNMT1介导IFFD启动子高甲基化，阻断SP1结合从而抑制IFFD转录。IFFD作为ceRNA海绵吸附miR-370，上调GLI1表达，进而促进CASP3表达诱导GCs凋亡，抑制PCNA和CYP19A1表达，从而抑制GCs增殖和E2分泌，阻滞卵泡发育。
- 主要证据
- 通过5-Aza-CdR和DNMT1-siRNA处理猪GCs发现IFFD表达上调；RNA pull-down和双荧光素酶实验验证IFFD-miR-370-GLI1轴；ChIP和dCas9-TET1实验证明SP1结合受DNA甲基化调控；猪卵泡体外和小鼠体内实验证实IFFD的功能。
- 研究意义
- DNMT1介导的IFFD可能作为调控卵泡发育的潜在治疗靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
鉴定DNMT1介导的lncRNA IFFD
寻找并验证DNMT1调控的lncRNA
对5-Aza-CdR和DNMT1-siRNA处理的GCs进行RNA-seq，筛选差异表达lncRNA，并通过RACE获取全长，验证其编码潜力和亚细胞定位。
验证IFFD作为ceRNA调控miR-370-GLI1轴
验证IFFD通过海绵吸附miR-370调控GLI1表达
通过RNA pull-down、双荧光素酶报告基因、过表达/敲低IFFD和miR-370，检测miR-370和GLI1的表达变化。
验证DNMT1通过甲基化调控IFFD转录
探究DNMT1介导的DNA甲基化对IFFD转录的调控机制
通过BSP检测启动子甲基化状态，ChIP检测SP1结合，使用dCas9-TET1靶向去甲基化验证SP1结合和IFFD表达。
体内及离体验证IFFD功能
验证IFFD在猪卵泡和小鼠卵巢中的功能
在猪卵泡和小鼠卵巢中过表达或敲低IFFD，检测GCs凋亡、E2分泌、卵泡发育和青春期起始时间。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| DMEM/F12培养基 | -- | -- | |
| Lipofectamine 3000转染试剂 | Thermo Scientific | -- | |
| 药物处理 | 5-氮杂-2'-脱氧胞苷 | -- | -- |
| 细胞培养 | 生长分化因子9 | MCE | -- |
| 骨形态发生蛋白15 | MCE | -- | |
| 促卵泡激素 | MCE | -- | |
| 睾酮 | MCE | -- | |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | -- | -- |
| RNA-seq | Nanodrop 2000分光光度计 | -- | -- |
| Illumina Hiseq 2500测序平台 | Illumina | -- | |
| RT-qPCR | RevertAid第一链cDNA合成试剂盒 | Thermo | -- |
| SYBR Green实时荧光定量PCR预混液（2x） | Thermo | -- | |
| CFX96 Touch PCR仪 | Bio-Rad | -- | |
| EdU检测 | Cell-Light Edu Apollo试剂盒 | RiboBio | -- |
| 流式凋亡检测 | Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒 | BioVision | -- |
| guava easyCyte流式细胞仪 | Luminex | -- | |
| ELISA | 小鼠雌激素ELISA试剂盒 | Enzyme-linked Biotechnology | ml063198 |
| 猪雌激素ELISA试剂盒 | -- | ml002366 | |
| TUNEL检测 | TUNEL凋亡检测试剂盒 | Beyotime | -- |
| 荧光显微镜 | Nikon ECLIPSE Ti2荧光显微镜 | Nikon | -- |
| BSP | EZ DNA甲基化-Gold试剂盒 | ZYMO | -- |
| 去甲基化实验 | pdCas9-TET1-CD载体 | ADDGENE | 83340 |
| ChIP | Pierce ChIP试剂盒 | Thermo | -- |
| SP1抗体 | proteintech | 21962-1-AP | |
| IgG抗体 | Millipore | 12-370 | |
| FISH | Ribo荧光原位杂交试剂盒 | RiboBio | -- |
| 共聚焦显微镜（FV3000） | OLYMPUS | -- | |
| 双荧光素酶报告基因 | 双荧光素酶报告基因检测系统 | Promega | -- |
| Synergy Neo2酶标仪 | BioTek | -- | |
| Western blot | BCA蛋白定量试剂盒 | Beyotime | -- |
| DNMT1抗体 | abcam | ab188453 | |
| DNMT3A抗体 | CST | 32578 | |
| DNMT3B抗体 | CST | 57868 | |
| SP1抗体 | proteintech | 21962-1-AP | |
| PCNA抗体 | proteintech | 10205-2-AP | |
| CCND1抗体 | proteintech | 26939-1-AP | |
| CASP3抗体 | proteintech | 19677-1-AP | |
| BAX抗体 | proteintech | 50599-2-Ig | |
| CYP19A1抗体 | bioss | bs-0114R | |
| CYP11A1抗体 | bioss | bs-3608R | |
| GLI1抗体 | proteintech | 66905-1-Ig | |
| Tubulin抗体 | Abcam | ab7291 | |
| 山羊抗小鼠IgG H&L二抗 | Abcam | ab6789 | |
| 山羊抗兔IgG H&L二抗 | Abcam | ab205718 | |
| Tanon 5200 Muti化学发光成像系统 | Tanon | -- | |
| RNA pull-down | Pierce磁性RNA-蛋白Pull-Down试剂盒 | Thermo | -- |
| RACE | 5'/3'-RACE试剂盒 | Roche | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| DNMT1功能实验 | 5-Aza-CdR浓度（0.5 μM）和处理时间（24小时）；DNMT1过表达质粒（pcDNA3.1-DNMT1）转染量（500 ng）和敲低siRNA（DNMT1-siRNA1）效率；FSH（100 ng/mL）和睾酮（10 ng/mL）处理条件 阅读提示：Results部分DNMT1 regulates the proliferation and apoptosis of GCs，以及Materials and methods中Isolation and culture of GCs and follicles |
| IFFD-ceRNA实验 | RNA pull-down实验验证miR-370与IFFD结合；双荧光素酶报告基因中野生型/突变型IFFD和GLI1载体构建及miR-370 mimic浓度；IFFD过表达（pcDNA3.1-lnc IFFD）和敲低（si-lnc IFFD-1）效率 阅读提示：Results部分DNMT1-mediated the expression of IFFD as ceRNA for miR-370-GLI1 in GCs及IFFD as ceRNA for miR-370-GLI1 regulates the proliferation and apoptosis of GCs，以及Materials and methods中Dual-luciferase reporter gene assay、RNA pull down |
| IFFD转录调控实验 | BSP引物及区域（BSP1: −1309/−991）；DNMT1-siRNA处理后甲基化变化（从70%降至57.7%）；SP1结合位点（−1261/−1254）；ChIP实验条件和dCas9-TET1靶向去甲基化实验（dC-TET1载体及gIFFD） 阅读提示：Results部分DNMT1 blocks the binding of SP1 to inhibit the transcription of IFFD，以及Materials and methods中Bisulfite sequencing PCR、Chromatin Immunoprecipitation assay |
| 体内外功能验证 | 慢病毒LV-lnc IFFD和sh-lnc IFFD构建及感染复数；猪卵泡培养条件（血清-free DMEM/F12，38.5°C，5% CO2）；小鼠每组5只，每周腹腔注射1×10^7 TU慢病毒，共3周；E2浓度检测、卵泡统计和TUNEL凋亡 阅读提示：Results部分IFFD as ceRNA for miR-370-GLI1 regulates follicular development in pigs及IFFD as ceRNA for miR-370-Gli1 controls follicular development in mice，以及Materials and methods中Animals、Isolation and culture of GCs and follicles |