样本收集与处理
收集对虾循环血细胞，并进行rCREG处理以探究其对血细胞的影响。
从汕头当地养殖场购买对虾，分组为对照组、rEGFP组和rCREG组，每组15只，注射后8小时收集血淋巴，通过OptiPrep密度梯度离心富集血细胞。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
单细胞RNA测序分析虾类免疫细胞鉴定出巨噬细胞样吞噬细胞
Single-cell RNA sequencing analysis of shrimp immune cells identifies macrophage-like phagocytes.
实验完整度
高文献包含单细胞转录组分析、流式细胞术、吞噬抑制实验、qPCR和免疫印迹等多个独立证据层级，并包含功能验证（吞噬实验）。
主要模型
凡纳滨对虾（Penaeus vannamei）循环血细胞 单核细胞样血细胞2（MH2）亚群
重点核对
对虾来源：汕头当地养殖场 细胞处理：未处理、rEGFP（1 μg/g）或rCREG（1 μg/g）注射，8小时后收集血淋巴 单细胞RNA-seq平台：10x Genomics Chromium单细胞3'试剂盒v3.1 吞噬细胞标记：FITC标记的副溶血性弧菌（2×10^6颗粒/g）注射，2小时后收集血细胞 吞噬抑制：细胞松弛素D（5 μM/g）注射
摘要
尽管先天免疫在无脊椎动物中很重要，但无脊椎动物先天免疫细胞的多样性和功能在很大程度上是未知的。利用单细胞RNA测序，我们在白虾血淋巴中鉴定出原血细胞、单核细胞样血细胞和颗粒细胞是三种主要的细胞类型。我们的结果鉴定了一个新的巨噬细胞样亚群，称为单核细胞样血细胞2（MH2），其表达某些标记基因，包括Nlrp3和Casp1。这种虾血细胞亚型具有吞噬性，并表达标记物，表明与哺乳动物巨噬细胞存在一定的保守性。总之，我们的工作解析了一种具有重要经济价值的水生物种中血细胞的异质性，并鉴定了一个新的先天免疫细胞亚群，该亚群可能在虾对威胁该产业的传染病的免疫反应中扮演关键角色。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 凡纳滨对虾血淋巴中先天免疫细胞的类型和功能是什么？是否存在与哺乳动物巨噬细胞相似的细胞亚群？
- 核心机制
- 对虾血细胞中存在一种单核细胞样血细胞亚群MH2，表达Nlrp3和Casp1等炎症小体相关基因，具有吞噬活性，表现出与哺乳动物巨噬细胞的保守性。
- 主要证据
- 单细胞RNA测序鉴定出MH2亚群；FITC标记的副溶血性弧菌吞噬实验显示R1门细胞具有吞噬活性；qPCR和免疫印迹证实R1细胞高表达CHIT1、Lyz1、NAGA和NLRP3。
- 研究意义
- 该研究解析了对虾血细胞的异质性，提出了新的血细胞分类系统，鉴定的巨噬细胞样细胞可能是对虾免疫应答的关键细胞，为未来研究对虾疾病防控提供了基础。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
单细胞RNA测序及数据分析
鉴定对虾血细胞的异质性和不同细胞类型。
使用10x Genomics平台进行单细胞RNA测序，数据经Cell Ranger处理并映射到对虾基因组，通过Seurat进行聚类，鉴定出5种主要细胞类型和6种亚型，并进行轨迹分析和差异表达基因分析。
吞噬细胞标记和分选
标记并分选具有吞噬活性的血细胞，以验证MH2的功能。
向对虾注射FITC标记的副溶血性弧菌，2小时后收集血细胞，通过流式细胞术分选FITC高信号（R1）和低信号（R2）细胞。
吞噬功能验证
验证R1细胞是否具有吞噬活性和巨噬细胞样形态。
通过共聚焦显微镜观察R1细胞吞噬FITC-VP的情况，并使用细胞松弛素D抑制肌动蛋白聚合，验证吞噬活性。
基因和蛋白表达验证
验证分选的吞噬细胞（R1）是否高表达MH2标记基因。
收集R1和R2细胞，提取RNA和蛋白质，通过qPCR和免疫印迹检测CHIT1、Lyz1、NAGA和NLRP3的表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
单细胞转录组分析
细胞分化轨迹分析
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 样本处理 | OptiPrep密度梯度离心液 | Axis-shield | AS1114542 |
| 台盼蓝 | Solarbio | C0040 | |
| 吞噬细胞标记 | 异硫氰酸荧光素 | Bioss | D-9801 |
| 形态观察 | Hoechst 33342染色液 | Beyotime | C1028 |
| 蛋白表达检测 | 抗β-肌动蛋白抗体 | Beyotime | AF5003 |
| 抗NAGA抗体 | SinoBiological | 13686-T24 | |
| 抗LYZ1抗体 | Bioss Antibodies | bs-0816R | |
| 抗NLRP3抗体 | GenScript | -- | |
| RNA提取 | RNAprep Pure 微量RNA提取试剂盒 | TIANGEN | DP420 |
| cDNA合成 | 第一链cDNA合成试剂盒 | Beyotime | D7168M |
| 单细胞RNA-seq建库 | 3'端试剂盒v3.1 | 10 X Genomics | 1000268 |
| 细胞分选 | FACSMelody细胞分选仪 | BD Biosciences | -- |
| 流式分析 | BD Accuri C6 Plus流式细胞仪 | Becton Dickinson | -- |
| 共聚焦显微镜 | LSM800共聚焦显微镜 | Zeiss | -- |
| 蛋白质沉淀 | 脱氧胆酸钠 | Macklin | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 样本收集与处理 | 对虾来源、分组、注射剂量（rEGFP/rCREG 1 μg/g）、收集时间（8小时）、OptiPrep密度梯度离心条件。 阅读提示：见Materials and methods 'Collection of shrimp hemocytes with different treatments' |
| 单细胞RNA测序 | 10x Genomics试剂盒版本、细胞过滤标准（UMI、线粒体基因比例、检测基因数）、聚类参数（分辨率0.2）。 阅读提示：见Materials and methods 'Library preparation and ScRNA sequencing' 和 'Bioinformatics analysis of single-cell RNA sequencing data' |
| 吞噬细胞标记和分选 | FITC-VP注射剂量（2×10^6颗粒/g）、注射后收集时间（2小时）、荧光阈值（R1>2×10^3，R2<10^3）、分选细胞数量（50-100k事件）。 阅读提示：见Materials and methods 'Phagocytic cell labeling and sorting' 和 'Collection of sorted hemocyte RNA and proteins for RT-qPCR and immunoblot analyses' |
| 吞噬功能验证 | 细胞松弛素D浓度（5 μM/g）、共聚焦显微镜型号、Hoechst染色条件。 阅读提示：见Materials and methods 'Morphological analysis of sorted hemocyte and phagocytosis inhibition assay' |
| 基因和蛋白表达验证 | qPCR内参基因（EF-1α）、重复次数（qPCR 5次，免疫印迹3次）、抗体稀释比例（1:200）。 阅读提示：见Materials and methods 'Collection of sorted hemocyte RNA and proteins for RT-qPCR and immunoblot analyses' 和 'Statistical Analyses' |