DHX34互作蛋白鉴定
鉴定DHX34相互作用蛋白，以探索其新功能。
使用CRISPR/Cas9在HEK293T细胞中内源标记DHX34-GFP-FLAG，通过免疫沉淀和质谱分析鉴定互作蛋白。
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RNA解旋酶DHX34在NMD和前体mRNA剪接中的双重作用及其在造血分化中的功能
A dual role for the RNA helicase DHX34 in NMD and pre-mRNA splicing and its function in hematopoietic differentiation.
实验完整度
高包含IP-MS、seCLIP、RNA-seq、RT-PCR、HSPC分化实验等多个独立证据层级，且包含功能验证和机制验证。
主要模型
HEK293T细胞（CRISPR标记DHX34） HeLa细胞（siRNA敲低） K562细胞（siRNA敲低和催化突变） 人脐带血CD34+ HSPCs（慢病毒敲低）
重点核对
DHX34敲低（siRNA）在HeLa和K562细胞中的效率和特异性 CRISPR标记的DHX34-GFP-FLAG克隆（A5、A10、1B3）的验证 HSPCs中DHX34敲低的效率和细胞分选（Dapi-CD34+GFP+） 红系和髓系分化条件（如细胞因子浓度和培养时间） 统计显著性阈值（如q≤0.05，dPSI≥0.05）
摘要
DExD/H-box RNA解旋酶DHX34是一种无义介导的衰变（NMD）因子，在线虫和脊椎动物中与核心NMD因子共同调控NMD靶标。在这里，我们显示DHX34也与人类剪接体催化C复合物相关。使用交联免疫沉淀（CLIP）对DHX34内源结合位点的定位显示，DHX34优先与前体mRNA结合，并位于外显子-内含子边界。因此，我们观察到DHX34在培养的哺乳动物细胞中调控大量可变剪接（AS）事件，确立了DHX34在NMD和前体mRNA剪接中的双重作用。我们之前表明，与家族性骨髓增生异常综合征（MDS）/急性髓系白血病（AML）易感性相关的胚系DHX34突变废除其在NMD中的活性。有趣的是，我们现在观察到DHX34调控与AML/MDS易感性相关的前体mRNA的剪接。这与造血干/祖细胞（HSPCs）中的沉默实验一致，表明DHX34的缺失导致红系和髓系分化阻滞，这是AML发展的标志。总之，这些数据揭示了DHX34的新细胞功能，并提示DHX34水平和/或活性的改变可能有助于人类疾病。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- DHX34是否除了在NMD中的作用外，还参与前体mRNA剪接调控，并影响造血分化？
- 核心机制
- DHX34与剪接体催化C复合物相关，结合前体mRNA外显子-内含子边界，调控可变剪接；其缺失导致红系和髓系分化阻滞。
- 主要证据
- IP-MS显示DHX34与剪接体蛋白互作；seCLIP显示DHX34结合外显子-内含子边界；RNA-seq显示DHX34敲低改变大量剪接事件；HSPC分化实验显示敲低DHX34导致红系和髓系集落形成减少。
- 研究意义
- 揭示DHX34在NMD和剪接中的双重作用，并提示DHX34水平和/或活性改变可能通过影响造血分化而贡献于MDS/AML发病。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
DHX34 RNA结合位点定位
在全基因组范围内鉴定DHX34的RNA结合位点。
使用seCLIP协议在DHX34-GFP-FLAG A5细胞中进行交联免疫沉淀，测序分析结合位点。
DHX34敲低对转录组和剪接的影响
评估DHX34对基因表达和可变剪接的全局影响。
在HeLa和K562细胞中用siRNA敲低DHX34，进行RNA-seq分析差异表达和剪接变化。
DHX34自身剪接调控
探究DHX34是否调控自身前体mRNA的剪接。
通过RT-PCR和RNA-seq分析DHX34敲低和催化突变细胞中DHX34外显子12b的剪接变化。
DHX34在造血分化中的作用
评估DHX34缺失对造血干/祖细胞分化的影响。
从人脐带血分离CD34+ HSPCs，用慢病毒敲低DHX34，进行集落形成实验和红系/髓系分化实验。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | Opti-MEM减血清培养基 | Gibco | 31985047 |
| RPMI培养基 | Gibco | -- | |
| siRNA转染 | DharmaFECT 1转染试剂 | Dharmacon | T-2001-03 |
| 免疫沉淀 | anti-GFP抗体偶联磁珠 | ChromoTek | -- |
| GFP-Trap-MA磁珠 | ChromoTek | -- | |
| 抗FLAG亲和凝胶 | Sigma | A2220 | |
| Western blot | NuPAGE LDS样本缓冲液 | Thermo Fisher | -- |
| NuPAGE 3%-8% Tris-醋酸预制胶 | Thermo Fisher | -- | |
| iBlot 2凝胶水平转移设备 | Thermo Fisher | -- | |
| HRP偶联二抗 | BioRad | -- | |
| ChemiGlow检测试剂 | ProteinSimple | -- | |
| ImageQuant LAS 4000化学发光相机 | GE Healthcare | -- | |
| RNA免疫沉淀 | M2琼脂糖 | Sigma | -- |
| 3XFLAG肽 | -- | -- | |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Thermo Fisher | -- |
| Western blot抗体 | 抗DDX41抗体 | Cell Signaling | 15076 |
| 抗PRP19抗体 | Abcam | ab27692 | |
| 抗ISY1抗体 | Atlas Antibodies | HPA016995 | |
| 抗SMG1抗体 | Abcam | ab30916 | |
| 抗UPF1抗体 | Bethyl | A300-036A | |
| 抗Pelota抗体 | BioSS | bs-7821R | |
| 抗RP6抗体 | Cell Signaling | 2217 | |
| 抗GFP抗体 | Abcam | ab290 | |
| 抗微管蛋白抗体 | Sigma-Aldrich | 4026 | |
| 抗DHX34抗体 | Eurogentec | -- | |
| RNA-seq | RNeasy试剂盒 | Qiagen | -- |
| TURBO DNA-free DNase I试剂盒 | Invitrogen Ambion | AM1907 | |
| qRT-PCR | RNeasy Mini试剂盒 | Qiagen | 74106 |
| Transcriptor通用cDNA预混液 | Roche | -- | |
| LightCycler 480实时荧光定量PCR仪 | Roche | -- | |
| GoTaq DNA聚合酶 | Promega | -- | |
| Bioanalyzer RNA 6000 Nano分析 | Agilent | -- | |
| HSPC分离 | Ficoll-Paque PLUS密度梯度分离液 | GE Healthcare Life Sciences | -- |
| EasySep人CD34阳性分选试剂盒II | STEMCELL Technologies | 17856 | |
| 慢病毒生产 | shRNA_DHX34#1 | VectorBuilder | -- |
| shRNA_DHX34#2 | VectorBuilder | -- | |
| shRNA对照 | VectorBuilder | -- | |
| HSPC培养 | StemSpan培养基 | STEMCELL Technologies | 09655 |
| 干细胞因子 | PeproTech | 300-07 | |
| Flt-3配体 | PeproTech | 300-19 | |
| 白细胞介素-6 | PeproTech | 200-06 | |
| 粒细胞集落刺激因子 | PeproTech | 300-23 | |
| 促血小板生成素 | PeproTech | AF-300-18 | |
| HEPES缓冲液 | Sigma-Aldrich | H0887-100 mL | |
| DAPI染色液 | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| RT-qPCR | High-Capacity cDNA逆转录试剂盒 | Thermo Fisher | 4368814 |
| DHX34 TaqMan探针 | Thermo Fisher | Hs00991248_m1 | |
| B2M TaqMan探针 | Thermo Fisher | Hs00984230_m1 | |
| 集落形成实验 | MethoCult H4434甲基纤维素培养基 | STEMCELL Technologies | 04434 |
| 青霉素/链霉素 | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| 红系分化 | 促红细胞生成素 | PeproTech | 100-64 |
| 胰岛素样生长因子1 | PeproTech | 100-11 | |
| 红系分化流式抗体 | CD71 PE抗体 | -- | RRID:AB 2201481 |
| CD235a APC/Cyanine7抗体 | -- | RRID:AB_2650977 | |
| 髓系分化 | 粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 | PeproTech | 300-03 |
| 髓系分化流式抗体 | CD11b APC抗体 | -- | RRID:AB_10561676 |
| CD14 PE-Cy7抗体 | -- | RRID:AB_1582277 | |
| CD45 APC eFluor780抗体 | -- | RRID:AB_1944368 | |
| 流式分析 | Fortessa流式细胞仪 | BD Biosciences | -- |
| 细胞周期和凋亡 | BD Cytofix/Cytoperm试剂盒 | BD Biosciences | 554714 |
| 细胞凋亡 | Alexa Fluor 647 Annexin V | BioLegend | 640912 |
| Annexin V结合缓冲液 | BD Bioscience | 556454 | |
| 细胞计数 | Countess 3自动细胞计数仪 | Thermo Fisher | -- |
| 质谱分析 | KingFisher Duo自动化磁珠提取仪 | Thermo | -- |
| Dionex RSLC纳升液相系统 | Thermo | -- | |
| Q-Exactive Plus质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | 培养基类型、血清浓度、CO2条件、siRNA转染剂量和方案 阅读提示：Materials and Methods: Cell culture and transfections |
| DHX34互作蛋白鉴定 | CRISPR克隆（A5、A10、1B3）、IP缓冲液成分、质谱分析参数 阅读提示：Materials and Methods: Mass spectrometry; Figure 1 |
| seCLIP | DHX34-GFP-FLAG A5克隆、anti-GFP beads、RNase处理、测序平台和分析参数 阅读提示：Materials and Methods: seCLIP protocol; Figure 2 |
| 转录组分析 | siRNA敲低条件、RNA提取、文库制备、测序平台、分析参数（如q≤0.005） 阅读提示：Materials and Methods: Gene expression profiling and RNA-sequencing analysis; Figures 3 and 4 |
| HSPC分化实验 | CD34+细胞分离方法、慢病毒MOI、细胞因子浓度、培养天数、流式抗体 阅读提示：Materials and Methods: CD34+ isolation, Lentivirus production, CD34+ UCB cells transduction, Colony forming assay, Erythroid differentiation, Granulocytic differentiation; Figure 6 |