仔猪体内感染模型建立与组织损伤评估
验证L. johnsonii L531对S. Infantis引起的肠道组织损伤的保护作用
将仔猪分为对照组、S. Infantis感染组和L. johnsonii L531预处理组，进行组织病理学观察。
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约氏乳杆菌L531通过调节NOD激活、内质网应激和自噬保护免受婴儿沙门氏菌诱导的肠道损伤
Lactobacillusjohnsonii L531 Protects against Salmonella Infantis-Induced Intestinal Damage by Regulating the NOD Activation, Endoplasmic Reticulum Stress, and Autophagy.
实验完整度
高包含仔猪体内模型和Caco2细胞体外模型两个独立证据层级，并进行了Western blot、免疫荧光、电子显微镜、siRNA敲低等功能和机制验证。
主要模型
仔猪腹泻模型 Caco2细胞感染模型
重点核对
S. Infantis感染浓度：1.0 × 10^11 CFU/mL，10 mL，第8天攻毒 L. johnsonii L531预处理：1.0 × 10^10 CFU/mL，10 mL，第1至7天每日一次 Caco2细胞感染复数：S. Infantis MOI=20，L. johnsonii L531 MOI=50，预处理3小时 自噬降解抑制剂氯喹（CQ）处理2小时 RIP2 siRNA转染条件：60-80%汇合度，转染5小时后继续培养36小时
摘要
肠炎沙门氏菌血清型婴儿型（S. Infantis）是一种胞内细菌病原体。它普遍存在但对抗生素耐药。因此，抗生素对沙门氏菌感染的治疗效果有限。在本研究中，我们使用仔猪腹泻模型和Caco2细胞模型来探讨益生菌约氏乳杆菌L531（L. johnsonii L531）对抗S. Infantis感染的机制。L. johnsonii L531减轻了S. Infantis诱导的肠道结构和细胞超微结构损伤。S. Infantis感染后，NOD通路相关蛋白（NOD1/2、RIP2）、自噬相关关键蛋白（ATG16L1、IRGM）和内质网（ER）应激标志物（GRP78、IRE1）的表达增加。值得注意的是，L. johnsonii L531预处理不仅抑制了上述信号通路的激活，还通过加速自噬降解发挥了抗S. Infantis感染的作用。然而，在Caco2细胞中，RIP2敲低并未干扰S. Infantis诱导的ER应激和自噬激活。我们的数据表明，L. johnsonii L531预处理通过抑制NOD激活、调节内质网应激以及促进自噬降解来减轻S. Infantis引起的肠道损伤。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 约氏乳杆菌L531如何通过调节NOD通路、内质网应激和自噬来保护肠道免受婴儿沙门氏菌感染？
- 核心机制
- L. johnsonii L531通过抑制NOD1/2激活、减轻内质网应激并促进自噬降解，从而减轻S. Infantis诱导的肠道损伤。RIP2不参与S. Infantis诱导的内质网应激和自噬。
- 主要证据
- 在仔猪模型中，L. johnsonii L531预处理降低了NOD1/2、RIP2、ATG16L1、IRGM的蛋白表达以及Il6 mRNA水平；在Caco2细胞中，L. johnsonii L531抑制了NOD通路和自噬相关蛋白，减轻了ER应激，并通过氯喹实验证明其促进自噬降解功能；siRNA敲低RIP2不影响自噬和ER应激相关蛋白。
- 研究意义
- 研究表明L. johnsonii L531在应对肠道致病菌中具有保护作用，为益生菌抗菌疗法的开发提供了潜在依据，未来需进一步研究NOD信号、自噬和ER应激之间的相互关联。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
NOD通路激活检测
检测S. Infantis感染和L. johnsonii L531对NOD通路蛋白表达的影响
通过免疫荧光和Western blot检测仔猪空肠和回肠中NOD1、NOD2、RIP2蛋白表达。
自噬相关蛋白检测
检测S. Infantis感染和L. johnsonii L531对自噬相关蛋白表达的影响
通过免疫荧光和Western blot检测ATG16L1和IRGM，以及Il6 mRNA表达。
Caco2细胞感染模型验证NOD和自噬
在体外验证L. johnsonii L531对NOD通路和自噬的影响
Caco2细胞分为对照组、S. Infantis感染组、L. johnsonii L531组和预处理组，检测相关蛋白表达和免疫荧光共定位。
自噬降解功能验证
验证L. johnsonii L531是否促进自噬降解
使用自噬降解抑制剂CQ处理Caco2细胞，比较LC3-II水平。
内质网应激和细胞超微结构观察
评估L. johnsonii L531对S. Infantis诱导的内质网应激和超微结构损伤的影响
通过SEM和TEM观察Caco2细胞超微结构，Western blot检测GRP78、IRE1、EIF2S1，RT-qPCR检测Il6和DDIT3 mRNA。
RIP2敲低验证
验证RIP2是否参与S. Infantis诱导的自噬和内质网应激
使用siRNA敲低Caco2细胞中RIP2，检测自噬和内质网应激蛋白表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 高糖DMEM培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 青霉素-链霉素 | -- | -- | |
| 细菌培养 | 庆大霉素 | -- | -- |
| RNA干扰 | Lipofectamine RNAiMAX转染试剂 | ThermoFisher Scientific | 13778075 |
| RIP2 siRNA | Shanghai GenePharma Co., Ltd. | -- | |
| 蛋白质印迹 | RIPA裂解液 | Solarbio | -- |
| BCA蛋白定量试剂盒 | ThermoFisher Scientific | 23227 | |
| PVDF膜 | Roche | -- | |
| ECL检测系统 | Tanon Science & Technology Co., Ltd. | -- | |
| NOD1单克隆抗体 | Santa Cruz | sc-398696 | |
| NOD2多克隆抗体 | Bioss | bs-7084R | |
| RIP2多克隆抗体 | Bioss | bs-3546R | |
| IRGM多克隆抗体 | Abcam | ab69494 | |
| IRE1多克隆抗体 | Abcam | ab37073 | |
| p62/SQSTM1多克隆抗体 | Proteintech | 18420-1-AP | |
| GAPDH单克隆抗体 | Proteintech | 60004-1-lg | |
| β-肌动蛋白单克隆抗体 | Proteintech | 60008-1-lg | |
| ATG16L1单克隆抗体 | Cell Signaling Technology | 8089 | |
| GRP78多克隆抗体 | Cell Signaling Technology | 3177 | |
| EIF2S1单克隆抗体 | Cell Signaling Technology | 5324 | |
| LC3A/B多克隆抗体 | Cell Signaling Technology | 4108 | |
| HRP标记亲和纯化山羊抗兔IgG (H+L) | Proteintech | SA00001-2 | |
| HRP标记亲和纯化山羊抗小鼠IgG (H+L) | Proteintech | HS201-01 | |
| RNA提取与RT-qPCR | EASYspin plus RNA提取试剂盒 | Aidlab Biotechnologies | -- |
| RT-qPCR | PrimeScript RT试剂盒 | TaKaRa | RR047A |
| SYBR Green PCR预混液 | Promega | LS2062 | |
| 引物 | Tsingke Biotechnology | -- | |
| 免疫荧光 | Triton-X 100 | Sigma-Aldrich | T8787 |
| 牛血清白蛋白 | -- | -- | |
| Alexa Fluor 488山羊抗兔 | -- | -- | |
| Alexa Fluor 555驴抗兔 | -- | -- | |
| DAPI染色液 | -- | -- | |
| Hoechst 33342染料 | -- | -- | |
| 共聚焦显微镜 | Leica | -- | |
| 共聚焦激光扫描显微镜 | Nikon | -- | |
| 自噬抑制实验 | 氯喹 | -- | -- |
| ER应激诱导 | 毒胡萝卜素 | -- | -- |
| 衣霉素 | -- | -- | |
| 统计分析 | GraphPad Prism 8 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 仔猪分组与感染 | 仔猪分组、菌株和剂量、攻毒时间、死检时间 阅读提示：Materials and Methods Section 4.3 (Animals and Specimens) |
| 细菌准备 | 菌株来源和制备方法 阅读提示：Materials and Methods Section 4.2 (Bacterial Strains and Preparation) |
| Caco2细胞感染模型 | 细胞培养条件、MOI、预处理时间、感染时间、庆大霉素浓度和作用时间 阅读提示：Materials and Methods Section 4.5 (In Vitro Caco2 Cell Infection Model) |
| RNA干扰 | siRNA序列、转染试剂、细胞汇合度、转染时间、后续培养时间 阅读提示：Materials and Methods Section 4.6 (RNA Interference) |
| Western blot | 蛋白裂解液、抗体稀释比例、孵育时间和温度 阅读提示：Materials and Methods Section 4.7 (Western Blotting) |
| RT-qPCR | RNA提取试剂盒、反转录试剂盒、SYBR Green Master Mix、引物序列、内参基因 阅读提示：Materials and Methods Section 4.8 (Quantitative Real-Time PCR) 和 Table 1, Table 2 |
| 免疫荧光 | 固定液、通透液、封闭液、抗体稀释比例、孵育条件、核染色 阅读提示：Materials and Methods Section 4.10 (Immunofluorescence) |
| 自噬降解抑制实验 | CQ浓度、处理时间 阅读提示：Results Section 2.5 |