构建肝细胞特异性Wtap敲除小鼠并评估表型
验证肝WTAP缺失是否导致NASH表型
通过Wtapflox/flox与Alb-Cre杂交生成Wtap-HKO小鼠，在正常饮食下检测体重、肝脏外观、TAG水平、Oil Red O染色、血清ALT、TUNEL、cleaved caspase3、F4/80染色、Sirius Red染色及纤维化标志物表达。
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肝细胞中WTAP的缺失诱导脂肪萎缩和非酒精性脂肪性肝炎（NASH）
Deficiency of WTAP in hepatocytes induces lipoatrophy and non-alcoholic steatohepatitis (NASH).
实验完整度
高包含肝细胞特异性敲除小鼠模型、原代肝细胞、体外过表达/敲低实验（ChIP-seq、ATAC-seq、RNA-seq、m6ARIP-seq）、功能验证（脂解、FFA摄取）及机制验证（HDAC1、CDK9）。
主要模型
肝细胞特异性Wtap敲除小鼠（Wtap-HKO） 原代肝细胞 HEK293T细胞 人NASH肝脏样本
重点核对
小鼠模型：Wtapflox/floxAlb-Cre+/-（肝细胞特异性敲除）与Wtapflox/flox对照，雄性，C57BL/6J背景 NASH饮食：6周龄小鼠喂养NASH饮食（D18402002，常州SYSE Bio-Tec）5周 IGFBP1中和抗体：7周龄Wtap-HKO小鼠，静脉注射anti-IGFBP1抗体（A11672，abclonal）4μg/只/天，持续5天 体外处理：原代肝细胞用TNFα（100 ng/ml）和棕榈酸（1 mM）处理20小时 统计分析：未配对双尾Student's t检验，p < 0.05为显著
摘要
异位脂质积累和炎症是NASH的基本标志。然而，NASH进展过程中异位脂质积累和炎症的分子机制尚未完全阐明。在此，我们报道了肝Wilms瘤1相关蛋白（WTAP）是NASH进展过程中异位脂质积累和炎症的关键整合调节因子。肝脏特异性敲除Wtap导致NASH，这是由于白色脂肪组织脂肪分解增加、肝脏游离脂肪酸摄取增强以及炎症诱导，这些分别由IGFBP1、CD36和细胞趋化因子如CCL2介导。WTAP与富含启动子的特定DNA基序结合，并在HDAC1的参与下抑制基因表达（如Igfbp1、Cd36和Ccl2）。在NASH中，WTAP从细胞核转位至细胞质，这与CDK9介导的磷酸化有关。这些数据揭示了肝WTAP在NASH进展过程中调节异位脂质积累和炎症的机制。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 肝WTAP在NASH进展中如何调控异位脂质积累和炎症？
- 核心机制
- WTAP通过招募HDAC1至Igfbp1、Cd36和Ccl2启动子，介导H3K9ac和H3K27ac去乙酰化，抑制其转录；NASH中CDK9介导的WTAP磷酸化导致其从细胞核转位至细胞质，从而解除抑制。
- 主要证据
- 肝细胞特异性敲除Wtap小鼠表现出NASH表型，包括脂肪肝、肝损伤、炎症和纤维化；RNA-seq、ATAC-seq、ChIP-seq和ChIP-qPCR证明WTAP直接结合并抑制Igfbp1、Cd36和Ccl2；中和IGFBP1可减轻NASH。
- 研究意义
- 揭示WTAP/HDAC1轴作为NASH治疗潜在药物靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
转录组和表观遗传分析
鉴定Wtap缺失后肝脏基因表达和染色质可及性变化
对Wtap-HKO和对照小鼠肝脏进行RNA-seq、ATAC-seq、ChIP-seq和m6ARIP-seq分析，鉴定差异表达基因和WTAP结合位点。
验证WTAP对靶基因的直接转录抑制作用
验证WTAP是否直接结合并抑制Igfbp1、Cd36和Ccl2启动子
在FLAG-WTAP过表达原代肝细胞中进行ChIP-qPCR；在HEK293T细胞中进行启动子荧光素酶报告基因实验。
验证WTAP/HDAC1介导的组蛋白去乙酰化
验证WTAP通过HDAC1调节H3K9ac和H3K27ac水平
在Wtap-HKO肝脏和WTAP过表达原代肝细胞中ChIP-qPCR检测H3K9ac/H3K27ac；免疫共沉淀验证WTAP与HDAC1相互作用；使用HDAC抑制剂TSA处理过表达WTAP的肝细胞。
验证IGFBP1介导的脂肪分解
验证肝源性IGFBP1是否促进eWAT脂肪分解
检测Wtap-HKO小鼠血清FFAs、eWAT重量、脂解相关蛋白（p-HSL、ATGL等）和cAMP水平；使用IGFBP1中和抗体处理；体外脂肪分解实验。
验证CDK9介导的WTAP核转位
验证NASH条件下CDK9磷酸化WTAP并促进其从核转位至胞质
用TNFα/PA处理原代肝细胞，检测WTAP核质分布和磷酸化；免疫共沉淀和体外激酶实验验证CDK9与WTAP相互作用并磷酸化；使用CDK9抑制剂BAY-1143572验证。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
评估体内效果
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 动物实验 | NASH饮食 | Changzhou SYSE Bio-Tec. Co.,Ltd. | D18402002 |
| 抗IGFBP1抗体 | abclonal | A11672 | |
| 兔IgG | Bioss | bs-0295p | |
| 血清生化分析 | ALT试剂盒 | Nanjing Jiancheng | C009-2-1 |
| 游离脂肪酸试剂盒 | Nanjing Jiancheng | A042-2-1 | |
| 小鼠IGFBP-1 ELISA试剂盒 | BOSTER | EK0383 | |
| 小鼠TNF-α ELISA试剂盒 | Proteintech | KE10002 | |
| 小鼠IL-1β ELISA试剂盒 | Proteintech | KE10003 | |
| 小鼠MCP-1 ELISA试剂盒 | Proteintech | KE10006 | |
| 小鼠/大鼠IGF1 ELISA试剂盒 | Proteintech | KE10032 | |
| 脂肪分解检测 | cAMP ELISA试剂盒 | Cayman | 581001 |
| 组织染色 | 油红O | Sigma | O0625 |
| 直接红80 | Sigma | 365548 | |
| F4/80抗体 | CST | 30325 | |
| TUNEL检测试剂盒 | Roche | 11684795910 | |
| 游离脂肪酸摄取实验 | BODIPY FL C16 | -- | -- |
| 细胞分离培养 | II型胶原酶 | Worthington Biochem | -- |
| RNA提取 | TriPure分离试剂 | Roche | 94015120 |
| RT-qPCR | M-MLV逆转录酶 | Promega | -- |
| LightCycler 480实时荧光定量PCR系统 | Roche | -- | |
| 脂质检测 | 游离甘油试剂 | Sigma | F6428 |
| 蛋白检测 | 抗磷酸丝氨酸抗体 | Sigma | AB1603 |
| 免疫沉淀 | 蛋白A琼脂糖珠 | Pierce | 20333 |
| 蛋白酶K | Solarbio | P1120 | |
| 染色质免疫沉淀 | 抗FLAG M2磁珠 | Millipore | M8823 |
| 色谱分析 | 5500 QTRAP三重四极杆质谱仪 | SCIEX | -- |
| 高效液相色谱系统 | Shimadzu | -- | |
| m6ARIP-seq | m6A抗体 | Synaptic System | 202003 |
| Dynabeads mRNA纯化试剂盒 | Invitrogen | -- | |
| NEBNext ultra RNA文库制备试剂盒 | New England Biolabs | -- | |
| ChIP-seq | truChIP染色质剪切试剂盒 | Covaris | 520127 |
| 聚焦超声破碎仪M220 | Covaris | -- | |
| 体外激酶实验 | 抗MYC磁珠 | Bimake | B26301 |
| 转染试剂 | 聚乙烯亚胺 | Sigma | -- |
| HDAC抑制实验 | 曲古抑菌素A | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物模型建立 | 小鼠基因型（Wtapflox/floxAlb-Cre+/-），性别（雄性），遗传背景（C57BL/6J），周龄（8周） 阅读提示：Methods: Animal experiments |
| NASH饮食诱导 | 饮食成分（NASH diet D18402002），喂养周期（5周），起始周龄（6周） 阅读提示：Methods: Animal experiments |
| IGFBP1中和实验 | 抗体剂量（4μg/小鼠），给药方式（静脉注射），给药周期（5天），对照（Rabbit IgG） 阅读提示：Methods: Animal experiments |
| 原代肝细胞分离与处理 | 胶原酶类型（II型），处理条件（TNFα 100ng/ml + PA 1mM，20小时），CDK9抑制剂浓度（BAY-1143572 4μM） 阅读提示：Methods: Primary hepatocyte culture and adenoviral infection; Figure 7 |
| FFA摄取实验 | BODIPY FL C16浓度（体内20μM注射20分钟；体外1μM孵育30分钟） 阅读提示：Methods: Free Fatty acid uptake assays |