母体妊娠后期营养不良对绵羊胎儿肾周棕色脂肪组织中参与生长发育的调节因子的影响

Effects of maternal undernutrition during late pregnancy on the regulatory factors involved in growth and development in ovine fetal perirenal brown adipose tissue.

作者信息Huan Yang, Chi Ma, Yang Zi, Min Zhang, Yingchun Liu, Kaifeng Wu, Feng Gao
PMID34530507
发布时间2022-07
DOI10.5713/ab.21.0199

实验完整度

包含体内动物模型(母羊营养限制)、组织学检测、免疫组化、蛋白质印迹和实时荧光定量PCR等多个独立实验层级,并进行了功能与机制验证。

主要模型

妊娠母羊模型(蒙古母羊) 绵羊胎儿肾周棕色脂肪组织

重点核对

母羊分组:RG2(0.18 MJ ME/kg BW0.75/d)、RG1(0.33 MJ ME/kg BW0.75/d)、CG(自由采食,0.67 MJ ME/kg BW0.75/d) 处理时间:妊娠第90天至第140天 胎儿组织采集时间:妊娠第140天 样本量:每组6只母羊 统计分析:采用方差分析,显著性水平p≤0.05

摘要

目的:本试验旨在评估母体妊娠后期营养不良对绵羊胎儿肾周棕色脂肪组织(BAT)中参与生长发育的基因表达的影响。方法:在妊娠第90天,将18只怀有单胎的母羊随机分为三组:限制组1(RG1,0.33 MJ 代谢能[ME]/kg 体重[BW]0.75/天,n = 6)、限制组2(RG2,0.18 MJ ME/kg BW0.75/天,n = 6)和对照组(CG,自由采食,0.67 MJ ME/kg BW0.75/天,n = 6)。在妊娠第140天取出胎儿。所有数据均使用方差分析程序进行分析。结果:与CG相比,RG2组的肾周脂肪重量(p = 0.0077)和肾周脂肪生长速率(p = 0.0074)降低。在胎儿肾周BAT中,与CG相比,RG1和RG2组的解偶联蛋白1(UCP1)蛋白水平(p = 0.0001)较低,且RG2组的UCP1 mRNA表达(p = 0.0265)降低。Myf5蛋白水平在RG2组也降低(p = 0.0001)。此外,RG1和RG2组中CyclinA(p = 0.0109)、CyclinB(p = 0.0019)、CyclinD(p = 0.0015)、周期蛋白依赖性激酶1(CDK1)(p = 0.0001)、E2F转录因子1(E2F1)(p = 0.0323)、E2F4(p = 0.0101)和E2F5(p = 0.0018)的mRNA表达较低。RG2组中过氧化物酶体增殖物激活受体-γ(PPARγ)蛋白表达(p = 0.0043)和CCAAT/增强子结合蛋白-α(C/EBPα)mRNA表达(p = 0.0307)降低,RG2和RG1组中PPARγ mRNA表达(p = 0.0008)和C/EBPα蛋白表达(p = 0.0015)均降低。此外,RG2组中骨形态发生蛋白4(BMP4)(p = 0.0083)和BMP7(p = 0.0330)的mRNA表达降低,RG2和RG1组中过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子-1α(PGC-1α)降低。结论:我们的观察支持,在妊娠后期母体营养不良时,促进分化和发育的调节因子的抑制导致胎儿肾周脂肪中BAT成熟的抑制。

实验结论

提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。

研究问题
母体妊娠后期营养不良对绵羊胎儿肾周棕色脂肪组织生长和发育调节因子的影响及其机制。
核心机制
母体营养不良降低BAT前体细胞增殖相关细胞周期调节因子(CyclinA/B/D、CDK1、E2F1/4/5)的表达,并抑制BMP4、BMP7等前体细胞发育调节因子,最终导致PPARγ、C/EBPα和PGC-1α等促分化因子表达降低,从而抑制BAT成熟。
主要证据
通过母羊营养限制模型,检测胎儿肾周脂肪重量、生长速率,免疫组化和Western blot检测UCP1、Myf5、PPARγ、C/EBPα蛋白水平,RT-qPCR检测相关基因mRNA表达。
研究意义
研究提出BAT成熟抑制可能是新生羔羊低温症和高死亡率的重要潜在机制之一。

研究路径

按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

1

建立母体营养不良模型

模拟母体妊娠后期营养不良对胎儿的影响。

将18只蒙古母羊于妊娠第90天随机分为RG2、RG1和CG三组,分别饲喂不同能量水平的日粮(0.18、0.33和0.67 MJ ME/kg BW0.75/d),持续至妊娠第140天。

2

采集胎儿样本

获取胎儿肾周脂肪组织用于后续分析。

在妊娠第140天取出胎儿,分离并称重肾周脂肪组织,部分组织迅速冷冻于液氮并保存于-80°C,部分组织用多聚甲醛固定、石蜡包埋并切片。

3

组织学染色

观察肾周脂肪组织的形态结构。

使用H&E染色试剂盒对石蜡切片进行苏木精-伊红染色,镜下观察BAT和WAT细胞形态。

4

免疫组化检测

检测UCP1、PPARγ和C/EBPα在肾周脂肪组织中的表达定位和水平。

使用特异性一抗(PPARγ、C/EBPα、UCP1)对组织切片进行免疫组化染色,并通过图像分析计算阳性信号面积分数。

5

蛋白质印迹检测蛋白表达

定量检测UCP1、Myf5、PPARγ、C/EBPα等蛋白的表达水平。

提取组织总蛋白,BCA法测定浓度,SDS-PAGE分离后转膜,一抗孵育过夜,荧光二抗孵育,成像并分析蛋白条带密度。

6

实时荧光定量PCR检测mRNA表达

检测相关基因的mRNA表达水平。

提取总RNA,逆转录为cDNA,使用SYBR Green进行RT-qPCR,以β-actin为内参,采用2-ΔΔCt法计算相对表达量。

研究方法

按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。

数据分析与统计

产品清单

实验环节名称品牌货号
Medison-SA-600超声诊断仪----
H&E染色试剂盒NJJCBIOD006
PPARγ抗体BIOSSbs4590R
C/EBPα抗体Gene TexGTX100674
UCP1抗体Abcamab10983
HRP标记二抗Abcamab205718
Leica显微镜LeicaDM750
RIPA裂解液ⅠSangon BiotechC5000050010
BCA蛋白定量试剂盒Sangon BiotechC5030210500
5× SDS-PAGE上样缓冲液SolarbioP1040
SDS-PAGE制备试剂盒Sangon BiotechC631100
PVDF膜Millipore--
Myf5抗体Abcamab139523
β-actin抗体Biossbs0061R
GAPDH抗体TransGenHC301
IRDye 800CW山羊抗兔IgGLi-COR Biotechnology--
Odyssey CLx成像系统Li-COR Biotechnology--
RNAiso Plus试剂Takara9109
PrimeScript RT试剂盒TakaraRR047B
SYBR Premix Ex TaqTakaraRR820A
LightCycler480 PCR仪Roche--

关键环节

汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

环节核对要点
动物模型
母羊品种为蒙古羊,第2或第3胎,妊娠第90天体重约为52.82±2.67 kg;分娩前确认单胎;分组及营养水平:CG(0.67 MJ ME/kg BW0.75/d)、RG1(0.33 MJ ME/kg BW0.75/d)、RG2(0.18 MJ ME/kg BW0.75/d)
阅读提示:详见Materials and Methods中的Animals and treatments
组织采集
在妊娠第140天采集胎儿肾周脂肪组织,部分组织液氮速冻后-80°C保存,部分组织用0.1 mol/L多聚甲醛固定并石蜡包埋
阅读提示:详见Materials and Methods中的Tissue sample collection
组织染色与免疫组化
H&E染色使用D006试剂盒;免疫组化使用PPARγ、C/EBPα、UCP1一抗,二抗为HRP标记;抗原修复20分钟,3% H2O2封闭10分钟,正常山羊血清封闭2小时;图像分析使用Leica显微镜和Image J
阅读提示:详见Materials and Methods中的Immunohistochemistry
蛋白质印迹
一抗:UCP1、Myf5、PPARγ、C/EBPα、β-actin、GAPDH;二抗:IRDye 800CW;使用Odyssey CLx成像系统
阅读提示:详见Materials and Methods中的Immunoblotting and antibodies
RT-qPCR
RNA提取使用RNAiso Plus,逆转录使用PrimeScript RT试剂盒;SYBR Premix Ex Taq;内参基因β-actin;每个样本三次重复;引物序列见表3
阅读提示:详见Materials and Methods中的Real-time polymerase chain reaction analysis和Table 3