建立母体营养不良模型
模拟母体妊娠后期营养不良对胎儿的影响。
将18只蒙古母羊于妊娠第90天随机分为RG2、RG1和CG三组,分别饲喂不同能量水平的日粮(0.18、0.33和0.67 MJ ME/kg BW0.75/d),持续至妊娠第140天。
Effects of maternal undernutrition during late pregnancy on the regulatory factors involved in growth and development in ovine fetal perirenal brown adipose tissue.
包含体内动物模型(母羊营养限制)、组织学检测、免疫组化、蛋白质印迹和实时荧光定量PCR等多个独立实验层级,并进行了功能与机制验证。
妊娠母羊模型(蒙古母羊) 绵羊胎儿肾周棕色脂肪组织
母羊分组:RG2(0.18 MJ ME/kg BW0.75/d)、RG1(0.33 MJ ME/kg BW0.75/d)、CG(自由采食,0.67 MJ ME/kg BW0.75/d) 处理时间:妊娠第90天至第140天 胎儿组织采集时间:妊娠第140天 样本量:每组6只母羊 统计分析:采用方差分析,显著性水平p≤0.05
提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
模拟母体妊娠后期营养不良对胎儿的影响。
将18只蒙古母羊于妊娠第90天随机分为RG2、RG1和CG三组,分别饲喂不同能量水平的日粮(0.18、0.33和0.67 MJ ME/kg BW0.75/d),持续至妊娠第140天。
获取胎儿肾周脂肪组织用于后续分析。
在妊娠第140天取出胎儿,分离并称重肾周脂肪组织,部分组织迅速冷冻于液氮并保存于-80°C,部分组织用多聚甲醛固定、石蜡包埋并切片。
观察肾周脂肪组织的形态结构。
使用H&E染色试剂盒对石蜡切片进行苏木精-伊红染色,镜下观察BAT和WAT细胞形态。
检测UCP1、PPARγ和C/EBPα在肾周脂肪组织中的表达定位和水平。
使用特异性一抗(PPARγ、C/EBPα、UCP1)对组织切片进行免疫组化染色,并通过图像分析计算阳性信号面积分数。
定量检测UCP1、Myf5、PPARγ、C/EBPα等蛋白的表达水平。
提取组织总蛋白,BCA法测定浓度,SDS-PAGE分离后转膜,一抗孵育过夜,荧光二抗孵育,成像并分析蛋白条带密度。
检测相关基因的mRNA表达水平。
提取总RNA,逆转录为cDNA,使用SYBR Green进行RT-qPCR,以β-actin为内参,采用2-ΔΔCt法计算相对表达量。
按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 动物饲养 | Medison-SA-600超声诊断仪 | -- | -- |
| 组织学染色 | H&E染色试剂盒 | NJJCBIO | D006 |
| 免疫组织化学 | PPARγ抗体 | BIOSS | bs4590R |
| C/EBPα抗体 | Gene Tex | GTX100674 | |
| UCP1抗体 | Abcam | ab10983 | |
| HRP标记二抗 | Abcam | ab205718 | |
| Leica显微镜 | Leica | DM750 | |
| 蛋白质印迹 | RIPA裂解液Ⅰ | Sangon Biotech | C5000050010 |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Sangon Biotech | C5030210500 | |
| 5× SDS-PAGE上样缓冲液 | Solarbio | P1040 | |
| SDS-PAGE制备试剂盒 | Sangon Biotech | C631100 | |
| PVDF膜 | Millipore | -- | |
| Myf5抗体 | Abcam | ab139523 | |
| β-actin抗体 | Bioss | bs0061R | |
| GAPDH抗体 | TransGen | HC301 | |
| IRDye 800CW山羊抗兔IgG | Li-COR Biotechnology | -- | |
| Odyssey CLx成像系统 | Li-COR Biotechnology | -- | |
| 实时荧光定量PCR | RNAiso Plus试剂 | Takara | 9109 |
| PrimeScript RT试剂盒 | Takara | RR047B | |
| SYBR Premix Ex Taq | Takara | RR820A | |
| LightCycler480 PCR仪 | Roche | -- |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物模型 | 母羊品种为蒙古羊,第2或第3胎,妊娠第90天体重约为52.82±2.67 kg;分娩前确认单胎;分组及营养水平:CG(0.67 MJ ME/kg BW0.75/d)、RG1(0.33 MJ ME/kg BW0.75/d)、RG2(0.18 MJ ME/kg BW0.75/d) 阅读提示:详见Materials and Methods中的Animals and treatments |
| 组织采集 | 在妊娠第140天采集胎儿肾周脂肪组织,部分组织液氮速冻后-80°C保存,部分组织用0.1 mol/L多聚甲醛固定并石蜡包埋 阅读提示:详见Materials and Methods中的Tissue sample collection |
| 组织染色与免疫组化 | H&E染色使用D006试剂盒;免疫组化使用PPARγ、C/EBPα、UCP1一抗,二抗为HRP标记;抗原修复20分钟,3% H2O2封闭10分钟,正常山羊血清封闭2小时;图像分析使用Leica显微镜和Image J 阅读提示:详见Materials and Methods中的Immunohistochemistry |
| 蛋白质印迹 | 一抗:UCP1、Myf5、PPARγ、C/EBPα、β-actin、GAPDH;二抗:IRDye 800CW;使用Odyssey CLx成像系统 阅读提示:详见Materials and Methods中的Immunoblotting and antibodies |
| RT-qPCR | RNA提取使用RNAiso Plus,逆转录使用PrimeScript RT试剂盒;SYBR Premix Ex Taq;内参基因β-actin;每个样本三次重复;引物序列见表3 阅读提示:详见Materials and Methods中的Real-time polymerase chain reaction analysis和Table 3 |