检测绵羊卵泡中P4合成酶和受体的表达及定位
验证P4合成酶和受体是否在绵羊卵泡中表达及其细胞定位。
采用免疫组织化学检测StAR、P450scc和PGR在有腔卵泡中的定位，并用细胞免疫荧光验证PGR在颗粒细胞中的表达。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
FSH和LH对绵羊卵泡发育过程中孕酮的调控
Regulation of progesterone during follicular development by FSH and LH in sheep.
实验完整度
高包含体内组织检测（免疫组化、ELISA、qRT-PCR、Western blot）和体外细胞培养及激素处理实验，且均有功能验证
主要模型
小尾寒羊卵泡颗粒细胞 绵羊有腔卵泡（大、中、小）
重点核对
卵泡大小分组（>5mm、2-5mm、<2mm） FSH和LH浓度（1、0.1、0.01 IU/mL） 颗粒细胞处理时间（24小时） P4含量检测方法（ELISA） qRT-PCR和Western blot检测StAR、P450scc、3β-HSD、PGR表达
摘要
孕酮（P4）可通过核受体（PGR）参与雌性哺乳动物有腔卵泡的发育。本实验通过酶联免疫吸附试验、免疫组织化学、qRT-PCR和Western blotting检测了绵羊有腔卵泡不同发育阶段（大>5mm，中2-5mm，小<2mm）P4合成和PGR表达的差异。其次，体外培养绵羊卵泡颗粒细胞，研究不同浓度的FSH和LH对P4合成和PGR表达的影响。结果表明，急性甾体调控蛋白（StAR）、胆固醇侧链裂解酶（P450scc）和3β-羟类固醇脱氢酶（3β-HSD）及PGR在有腔卵泡中均有表达，且随着绵羊有腔卵泡的发育，StAR、P450scc、3β-HSD和PGR的表达显著增加。体外实验表明，FSH和LH单独或联合处理均能不同程度地调节绵羊卵泡颗粒细胞P4分泌和PGR表达，提示P4和PGR受FSH和LH调控，且LH是主要因素。我们的结果补充了FSH和LH在卵泡发育过程中对P4合成调控的作用，为进一步研究卵泡发育中类固醇合成和功能提供了新的数据。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- FSH和LH如何调控绵羊卵泡发育过程中孕酮及其受体的表达？
- 核心机制
- FSH和LH通过调节颗粒细胞中StAR、P450scc、3β-HSD等合成酶及PGR的表达来调控P4分泌，且LH在调控PGR表达中起主导作用。
- 主要证据
- 绵羊有腔卵泡不同发育阶段中StAR、P450scc、3β-HSD和PGR表达随卵泡发育增加，且P4浓度在大卵泡中最高；体外培养颗粒细胞经FSH和LH单独或联合处理后，P4分泌和相关基因/蛋白表达发生显著变化。
- 研究意义
- 补充了FSH和LH在卵泡发育过程中对P4合成调控的作用，为深入研究卵泡发育中的类固醇合成和功能提供了新数据。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
比较不同发育阶段卵泡中P4含量及合成酶和受体表达
探究卵泡发育过程中P4合成能力和相关表达水平的变化。
分离大、中、小卵泡，用ELISA检测卵泡液P4浓度，用qRT-PCR和Western blot检测StAR、P450scc、3β-HSD和PGR的mRNA和蛋白表达。
体外培养颗粒细胞并处理FSH和LH
评估FSH和LH对颗粒细胞P4分泌及合成酶和受体表达的影响。
体外培养绵羊卵泡颗粒细胞，分别用不同浓度的FSH或LH单独处理，以及不同浓度FSH与LH联合处理，处理后检测P4分泌和相关基因/蛋白表达。
统计分析
评估不同处理组间差异的显著性。
使用SPSS进行单因素方差分析和Duncan及Tukey多重比较检验。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM/F12培养基 | Solarbio | -- |
| 胎牛血清 | Hyclone | -- | |
| 青霉素-链霉素 | -- | -- | |
| 透明质酸酶 | -- | -- | |
| 胰蛋白酶-EDTA | -- | -- | |
| 六孔板 | Corning | -- | |
| 促卵泡激素 | Solarbio | -- | |
| 促黄体生成素 | Solarbio | -- | |
| ELISA | 绵羊孕酮ELISA试剂盒 | Yingxin | -- |
| 免疫组织化学 | StAR抗体 | Bioss | bs-3570R |
| P450scc抗体 | Bioss | bs-10099R | |
| PGR抗体 | Bioss | bs-23376R | |
| 生物素化二抗 | -- | -- | |
| DAB显色液 | -- | -- | |
| 免疫组化 | 光学显微镜 | Olympus | DP73 |
| 免疫细胞化学 | Triton X-100 | -- | -- |
| 牛血清白蛋白 | -- | -- | |
| FITC标记的山羊抗小鼠IgG（H+L） | TransGen | -- | |
| DAPI | Solarbio | -- | |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Solarbio | -- |
| RT-qPCR | Prime Script RT试剂盒（含gDNA去除剂） | Takara | -- |
| SYBR Green II PCR预混液 | TaKaRa | -- | |
| LightCycler 480实时荧光定量PCR仪 | Roche | -- | |
| Western blot | RIPA裂解液 | -- | -- |
| BCA蛋白检测试剂盒 | BioTek | -- | |
| 5×上样缓冲液 | -- | -- | |
| PVDF膜 | Millipore | -- | |
| StAR抗体 | Bioss | bs-3570R | |
| P450scc抗体 | Bioss | bs-10099R | |
| PGR抗体 | Bioss | bs-23376R | |
| β-actin抗体 | Bioss | bs-0061R | |
| 山羊抗兔HRP标记二抗 | Bioss | bs-0295G-HRP | |
| 增强化学发光液 | Abnova | -- | |
| 数据分析 | ImageJ软件 | National Institutes of Health | -- |
| 统计分析 | SPSS统计软件 | IBM | 22.0 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 卵泡采集与分类 | 卵巢数量 n=80，卵泡分类标准（大>5mm、中2-5mm、小<2mm），运输条件（PBS含双抗，30-37°C，30分钟内） 阅读提示：Methods: Animals and tissue collection |
| 颗粒细胞培养与处理 | 消化时间（约10分钟），培养条件（37°C，95% O2/5% CO2），处理前无血清培养12小时，FSH和LH浓度（1、0.1、0.01 IU/mL），处理时间24小时，对照组设置 阅读提示：Methods: Culture and treatment of GCs |
| ELISA检测 | 试剂盒来源，测定波长450nm，样本处理（1500g离心5分钟，0.45μm过滤） 阅读提示：Methods: Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) |
| qRT-PCR | 引物序列（表1），内参基因（β-actin），扩增条件（95°C 10s, 95°C 5s, 60°C 30s，熔解曲线60-95°C） 阅读提示：Methods: Total ribonucleic acid (RNA) extraction and qRT-PCR |
| Western blot | 蛋白提取（RIPA+PMSF，12000g离心15分钟），BCA定量，抗体稀释比例（StAR、P450scc、PGR 1:500，β-actin 1:3000），内参β-actin 阅读提示：Methods: Western blotting |