建立肥胖模型并检测miR-203和ASBT表达
验证肥胖状态下miR-203和ASBT的表达变化
高脂饮食诱导SD大鼠肥胖模型，检测体重、血脂、血清总胆汁酸水平，并通过qRT-PCR和Western blot检测回肠中miR-203和ASBT的表达。
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miR-203通过靶向顶端钠依赖性胆汁酸转运体发挥抗肥胖作用
MiR-203 is an anti-obese microRNA by targeting apical sodium-dependent bile acid transporter.
实验完整度
高包含大鼠模型、转基因小鼠、细胞实验和人群样本等多个独立证据层级，并明确功能验证和机制验证。
主要模型
高脂饮食诱导的肥胖大鼠模型 miR-203过表达转基因小鼠 人小肠上皮细胞系HIEC 人回肠和血浆样本
重点核对
大鼠模型：8周龄SD大鼠，高脂饮食4周，随机分组，n=6 agomiR-203/antagomiR-203剂量：0.5 nmol，经回结肠动脉系膜注射和腹腔注射 转基因小鼠：TgN(miR-203)小鼠，高脂饮食9周，每周腹腔注射0.5 nmol antagomiR-203 细胞实验：HIEC转染miR-203 mimic/AMO，48小时后检测 人群样本：血浆105例，回肠60例，检测miR-203和ASBT表达
摘要
人类代谢；分子生物学
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- miR-203是否通过靶向ASBT调节胆汁酸稳态，从而影响肥胖和血脂异常的发生？
- 核心机制
- miR-203通过直接结合SLC10A2（ASBT）的3'UTR抑制其表达，导致回肠胆汁酸重吸收减少，增加粪便胆汁酸和脂质排泄，从而减轻肥胖和血脂异常；TCF7L2作为miR-203的上游转录因子，正向调控miR-203表达。
- 主要证据
- 在肥胖大鼠和miR-203转基因小鼠中，miR-203过表达降低ASBT表达、增加粪便胆汁酸和脂质排泄、减轻体重和改善血脂；双荧光素酶报告基因和Western blot验证ASBT为直接靶点；细胞实验显示miR-203抑制胆汁酸摄取；人群样本中miR-203与BMI负相关，ASBT与BMI正相关。
- 研究意义
- 本研究揭示TCF7L2/miR-203/ASBT轴在肥胖中的作用，为肥胖和血脂异常的早期预警、预防和治疗提供新思路。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
在肥胖大鼠中过表达或敲低miR-203
评估miR-203对肥胖和血脂异常的影响
通过腹腔注射agomiR-203、antagomiR-203或NC，检测miR-203表达、ASBT表达、体重、体脂、血脂和胆汁酸水平。
验证ASBT为miR-203的直接靶点
确认miR-203直接调控ASBT表达
双荧光素酶报告基因实验检测miR-203对SLC10A2野生型和突变型3'UTR的作用；在HIEC细胞中转染miR-203 mimic或AMO，检测ASBT表达和胆汁酸摄取。
miR-203转基因小鼠对高脂饮食诱导的肥胖和血脂异常的抗性
验证miR-203过表达在体内对肥胖和血脂异常的保护作用
对TgN(miR-203)小鼠和WT小鼠给予高脂饮食或正常饮食，部分转基因小鼠注射antagomiR-203，检测体重、体脂、血脂、粪便胆汁酸和脂质水平。
TCF7L2作为miR-203的上游转录因子
探究miR-203下调的机制
检测肥胖大鼠回肠中TCF7L2蛋白表达；在HIEC中过表达TCF7L2，检测miR-203表达；通过dODN、双荧光素酶报告基因、EMSA和ChIP实验验证TCF7L2与miR-203启动子的结合。
人群样本中miR-203和ASBT与肥胖的关系
评估miR-203和ASBT的临床相关性
检测人群血浆和回肠中miR-203表达及回肠ASBT mRNA水平，分析其与BMI的相关性。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 蛋白质检测 | 抗ASBT抗体 | Abcam | ab203205 |
| 抗TCF7L2抗体 | Bioss | bs-1280R | |
| 抗ASBT抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-27493 | |
| 抗TCF7L2抗体 | Abcam | ab76151 | |
| 抗GAPDH抗体 | OriGene | TA802519 | |
| RNA提取 | TRIzol RNA提取试剂 | Thermo Fisher Scientific | 15596026 |
| Western blot | RIPA裂解液 | Sularbio | r0010 |
| 动物饲养 | 高脂饮食 | Huafukang Biological Technology | 10045 |
| 逆转录 | 高效cDNA逆转录试剂盒 | Toyobo | fsq-101 |
| qRT-PCR | SYBR Green I | Toyobo | qps-201 |
| 免疫荧光 | Triton X-100 | Sularbio | t8200 |
| 细胞转染 | Opti-MEM培养基 | Invitrogen | 31985070 |
| X-tremeGENE HP DNA转染试剂 | Sigma | 4476115001 | |
| Western blot | 蛋白酶抑制剂混合物 | Shennengbocai | P1003 |
| 免疫荧光 | DAPI | beyotime | c1002 |
| 核蛋白提取 | 核质提取试剂 | Thermo Fisher Scientific | 78833 |
| 血脂检测 | 低密度脂蛋白胆固醇ELISA检测试剂盒 | Nanjing Jiancheng Biotech | A113-1-1 |
| 高密度脂蛋白胆固醇ELISA检测试剂盒 | Nanjing Jiancheng Biotech | A112-1-1 | |
| 甘油三酯ELISA检测试剂盒 | Nanjing Jiancheng Biotech | A110-1-1 | |
| 总胆固醇ELISA检测试剂盒 | Nanjing Jiancheng Biotech | F002-1-1 | |
| 胆汁酸检测 | 总胆汁酸检测试剂盒 | Nanjing Jiancheng Biotech | E003-1-1 |
| 脂质耐受试验 | 甘油三酯检测试剂盒 | Abbkine | KTB2200 |
| 游离脂肪酸检测试剂盒 | Elabscience | E-BC-K013-S | |
| ChIP实验 | 染色质免疫沉淀试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | 26156 |
| EMSA | 电泳迁移率变动分析试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | 20148 |
| 细胞培养 | HIEC细胞系 | ATCC | CCL-241 |
| HEK293细胞系 | ATCC | CRL-11268 | |
| 动物实验 | 小鼠：野生型C57BL/6JNifdc | Charles River Laboratories | 219 |
| 大鼠：野生型SD | Charles River Laboratories | 101 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 肥胖大鼠模型 | 大鼠品系、性别、周龄、体重、高脂饮食配方、诱导时间、分组、每组样本量 阅读提示：STAR★Methods: Obese rat model |
| agomiR/antagomiR处理 | 试剂序列、剂量、注射途径、注射时间点 阅读提示：STAR★Methods: Obese rat model; Figure 2 legend |
| 转基因小鼠实验 | 小鼠品系、周龄、饮食类型和周期、试剂剂量和注射频率、体重测量时间点 阅读提示：STAR★Methods: MiR-203 overexpression transgenic mice; Figure 4 legend |
| 细胞实验 | 细胞系来源、培养条件、转染试剂、转染浓度、检测时间点 阅读提示：STAR★Methods: HIEC cell line, Cell transfection; Figure 3 legend |
| 人群样本分析 | 样本量、纳入排除标准、BMI分组、检测方法 阅读提示：STAR★Methods: Human samples; Figure 8 legend |