scRNA-seq解析细胞图谱
揭示淋巴水肿脂肪组织SVF的细胞组成和亚群变化
收集5例淋巴水肿患者和4例健康供体脂肪组织，分离SVF，进行scRNA-seq，聚类分析鉴定细胞类型和亚群，比较组间比例。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
皮下脂肪组织的单细胞RNA测序确定癌症相关淋巴水肿的治疗靶点
Single-cell RNA sequencing of subcutaneous adipose tissues identifies therapeutic targets for cancer-associated lymphedema.
实验完整度
高包含患者样本的单细胞RNA测序、体外敲低实验、免疫荧光和流式验证、体内小鼠模型及药理学干预等至少两个独立的证据层级。
主要模型
患者皮下脂肪组织SVF细胞 淋巴水肿患者来源的ASCs 小鼠尾部淋巴水肿模型
重点核对
scRNA-seq样本：5例淋巴水肿患者（CASE）和4例健康供体（CTRL）的脂肪组织SVF CLEC3B敲低：ASCs来自3例淋巴水肿患者，使用siRNA（25 nM）转染，mRNA分析48h，蛋白分析96h mLR12治疗：小鼠尾部模型，术后2周开始每日腹腔注射5 mg/kg mLR12，持续6周 验证队列：队列I（4例淋巴水肿，7例健康）用于流式验证CD55高比例；队列II（3例淋巴水肿，3例健康）用于CLEC3B表达验证 统计方法：差异比例分析（置换检验），GSEA（FDR q<0.05），差异表达（调整P<0.05）
摘要
癌症相关淋巴水肿常在癌症治疗的淋巴结切除术后发生。然而，我们仍缺乏有效的靶向药物治疗来治疗或预防这种并发症。深入阐明淋巴水肿皮下脂肪组织的细胞变化对于医学发展至关重要。我们对淋巴水肿患者和健康供体脂肪组织基质血管组分的70,209个细胞进行了单细胞RNA测序。鉴定了四个脂肪来源基质细胞（ASCs）亚群。其中，PRG4+/CLEC3B+ ASC亚群c3在淋巴水肿中显著扩增，并与脂肪组织纤维化相关。体外敲低CLEC3B可显著减弱患者ASCs的纤维化。淋巴水肿的脂肪组织显示LYVE+抗炎巨噬细胞显著耗竭，并表现出促炎微环境。使用小鼠LR12（一种十二肽）药理学阻断Trem1（一种主要由促炎巨噬细胞表达的免疫受体），可显著减轻小鼠尾部模型中的淋巴水肿。细胞间通讯分析揭示了ASCs、巨噬细胞和血管内皮细胞之间的血管周围配体-受体相互作用模块。我们在单细胞分辨率下对淋巴水肿患者脂肪组织的谱系特异性变化进行了全面分析。发现CLEC3B是减轻脂肪组织纤维化的潜在靶点。使用LR12药理学阻断TREM1可作为一种有前景的药物治疗淋巴水肿。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 癌症相关淋巴水肿皮下脂肪组织中存在哪些细胞和分子变化，以及哪些可成为治疗靶点？
- 核心机制
- 淋巴水肿中PRG4+/CLEC3B+ ASC亚群扩增并促进纤维化；LYVE+抗炎巨噬细胞耗竭导致促炎微环境，TREM1+巨噬细胞加剧炎症，阻断TREM1可缓解淋巴水肿。
- 主要证据
- scRNA-seq显示c3 ASC扩增和c6巨噬细胞减少；体外敲低CLEC3B降低纤维化基因及SMAD2/3磷酸化；小鼠模型中mLR12减少炎症和纤维化，减轻水肿。
- 研究意义
- CLEC3B是减轻脂肪组织纤维化的潜在靶点；药理学阻断TREM1（如LR12）可能成为治疗淋巴水肿的医学疗法。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
ASC亚群鉴定与验证
验证淋巴水肿相关ASC亚群c3的存在及其分子特征
通过免疫荧光染色证实PRG4+ ASC在淋巴水肿和健康组织中的存在；通过流式细胞术在独立验证队列中比较CD55高细胞比例。
CLEC3B功能验证（体外）
检验CLEC3B在ASC纤维化中的作用
从淋巴水肿患者分离ASCs，siRNA敲低CLEC3B，通过bulk RNA-seq、qPCR、免疫印迹和免疫荧光评估纤维化相关基因和蛋白表达。
巨噬细胞亚群分析
表征巨噬细胞亚群的表型及其在淋巴水肿中的变化
通过scRNA-seq分析巨噬细胞亚群（c6, c8, c11）的基因表达，鉴定M2（LYVE1+）和M1（IL1Bhigh）表型，计算c6/c8比例。
体内药理学验证（mLR12）
评估Trem1阻断对淋巴水肿的治疗效果
建立小鼠尾部淋巴水肿模型，给予mLR12肽或对照，测量尾巴直径，进行组织学染色（H&E、Sirius red）和炎症标志物检测。
细胞间通讯分析
揭示淋巴水肿中细胞间信号变化
使用CellPhoneDB分析配体-受体相互作用，比较CASE与CTRL的通讯网络，识别特定相互作用模块的变化。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 杜氏改良Eagle培养基 | Gibco | 10569044 |
| SVF分离 | I型胶原酶 | Gibco | 17100017 |
| 细胞培养 | 青霉素-链霉素 | Gibco | 15140122 |
| 胎牛血清 | Gibco | 10099141 | |
| 细胞处理 | 牛血清白蛋白 | Sigma | A1933-5G |
| 细胞计数 | AOPI染色液 | Logos Biosystems | -- |
| LUNA-FL荧光细胞计数器 | Logos Biosystems | -- | |
| scRNA-seq | Chromium单细胞3'试剂盒v3 | 10x Genomics | -- |
| NovaSeq 6000系统 | Illumina | -- | |
| 基因敲低 | ON-TARGETplus人CLEC3B siRNA Smartpool | Horizon | L-019749-00-0005 |
| ON-TARGETplus非靶向池 | Horizon | D-001810-10-05 | |
| DharmaFECT 4 siRNA转染试剂 | Dharmacon | T-2004-02 | |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Invitrogen | 15596018 |
| RNA-seq | NEBNext Ultra RNA文库制备试剂盒（Illumina） | NEB | E7530L |
| qPCR | PrimeScript逆转录酶 | TaKaRa | 2680A |
| PowerUp SYBR Green预混液 | Applied Biosystems | A25742 | |
| 免疫印迹 | NP-40裂解液 | Beyotime | P0013F |
| Micro BCA蛋白测定试剂盒 | Thermo Scientific | 23235 | |
| Bis-Tris Bolt凝胶 | Invitrogen | NW04120BOX | |
| 纯硝酸纤维素转印膜 | Pall Life Sciences | 66485 | |
| 脱脂牛奶 | Beyotime | P0216 | |
| 牛血清白蛋白 | Beyotime | ST023 | |
| 含吐温-20的Tris缓冲盐水 | Beyotime | ST671 | |
| CLEC3B抗体 | Abcam | ab51883 | |
| I型胶原抗体 | Abcam | ab138492 | |
| SMAD2/3抗体 | Cell Signaling Technology | 3102S | |
| 磷酸化SMAD2/3抗体 | Cell Signaling Technology | 8828S | |
| HRP偶联二抗 | ZSGB-BIO | ZB-2301/2305 | |
| GAPDH抗体 | Cell Signaling Technology | 2118L | |
| 化学发光检测试剂 | Beyotime | P0018AM | |
| 脱钙 | 中性缓冲EDTA | LEAGENE | DD0002 |
| 组织脱水 | ASP300S脱水机 | Leica | -- |
| 切片 | RM2235切片机 | Leica | -- |
| 染色成像 | Pannoramic SCAN扫描仪 | 3DHISTECH | -- |
| Vectra Polaris病理成像系统 | PerkinElmer | -- | |
| H&E染色 | Varistain Gemini自动染色机 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 免疫荧光 | Alexa Fluor 488山羊抗兔 | Invitrogen | A-11008 |
| Alexa Fluor 594山羊抗小鼠 | Abcam | ab150116 | |
| DAPI封片剂 | ZSGB-BIO | ZLI-9557 | |
| PRG4抗体 | Abcam | ab28484 | |
| CHI3L1抗体 | Abcam | ab77528 | |
| CTHRC1抗体 | Abcam | ab85739 | |
| CXCL14抗体 | Abcam | ab46010 | |
| PDGFRα抗体 | R&D | MAB322 | |
| Cd11b抗体 | Abcam | ab8878 | |
| Trem1抗体 | Bioss | bs-4886R | |
| 细胞免疫荧光 | Triton X-100 | Diamond | A110694-0100 |
| DAPI | Cell Signaling Technology | 4083S | |
| Axio Vert.A1显微镜 | ZEISS | -- | |
| 流式细胞术 | 细胞染色缓冲液 | BioLegend | 420201 |
| PDGFRα(CD140a)-藻红蛋白 | BioLegend | 323506 | |
| CD55-别藻蓝蛋白 | BioLegend | 311312 | |
| Accuri C6流式细胞仪 | BD Biosciences | -- | |
| 动物处理 | 小鼠LR12肽 | SBS Genetech | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| scRNA-seq样本 | 样本量：5例淋巴水肿（CASE）和4例健康（CTRL）；样本来源：皮下脂肪组织（大腿）；分组匹配BMI（P=0.11） 阅读提示：Materials and methods: Adipose tissue specimen preparation and liposuction; Results: scRNA-seq reveals cellular diversity |
| SVF分离 | 胶原酶I浓度0.15%，37°C 30分钟；红细胞裂解；细胞活力>90% 阅读提示：Materials and methods: SVF isolation and cell viability assay |
| scRNA-seq建库测序 | 10x Genomics Chromium Single-Cell 3' v3；NovaSeq 6000；每例样本独立建库 阅读提示：Materials and methods: scRNA-seq |
| CLEC3B敲低 | ASCs来源：3例淋巴水肿患者；siRNA浓度25 nM；转染试剂DharmaFECT 4；mRNA分析48h，蛋白分析96h 阅读提示：Materials and methods: Knockdown of CLEC3B expression in ASCs |
| qPCR | 引物序列：CLEC3B, PRG4, FN1, CCN2, COL1A1, GAPDH等；参考基因GAPDH；2^-ΔΔCt相对定量 阅读提示：Materials and methods: RNA extraction and gene expression assay with qPCR |
| 免疫印迹 | 抗体：CLEC3B (ab51883), Collagen-1 (ab138492), SMAD2/3, pSMAD2/3, GAPDH；裂解液NP-40；蛋白量200-400 μg/样本 阅读提示：Materials and methods: Immunoblot assay |
| 小鼠模型 | C57雄性小鼠（4-6周龄）；手术破坏尾部深浅淋巴管；术后2周分组；mLR12剂量5 mg/kg/天，腹腔注射，持续6周；对照组scramble肽 阅读提示：Materials and methods: Animal model and treatment |
| 组织学分析 | 尾组织切片位置：切口远端1cm；H&E评估皮下组织厚度；Sirius red评估纤维化 阅读提示：Materials and methods: Paraffin section preparation; H&E staining; Sirius red staining |
| 统计方法 | 差异比例分析（置换检验，Bonferroni校正P<0.05）；GSEA（Signal2Noise排名，FDR q<0.05）；差异表达（FindMarkers，log2FC>0.25, adjP<0.05; sleuth q<0.05）；t检验/ Wilcoxon检验 阅读提示：Materials and methods: Differential expression and functional enrichment analysis; Gene set enrichment analysis; Differential proportion analysis; bulk RNA-seq data analysis |