评估35B5对Omicron的结合和中和活性
确定35B5是否能有效结合Omicron S蛋白并中和病毒。
通过ELISA检测35B5对WT、Delta、Omicron S蛋白的结合能力；通过假病毒中和实验检测对WT、Delta、Omicron假病毒的中和活性；通过活病毒中和实验检测对Omicron活病毒的中和活性。
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35B5抗体通过打断保守的刺突蛋白表位上的N-聚糖开关，有效中和SARS-CoV-2 Omicron变异株
35B5 antibody potently neutralizes SARS-CoV-2 Omicron by disrupting the N-glycan switch via a conserved spike epitope.
实验完整度
高包含体外中和实验、冷冻电镜结构分析、热稳定性实验及负染色分析等多个独立实验层级，并进行了功能验证和机制验证。
主要模型
HEK293F细胞表达的重组Omicron S-ECD三聚体 293T/ACE2细胞系 VeroE6-TMPRSS2细胞 SARS-CoV-2 Omicron活病毒HKU691
重点核对
35B5抗体对Omicron S蛋白的结合能力(EC50) 35B5对假病毒和活病毒的中和活性(IC50) Omicron S-ECD与35B5 Fab复合物的冷冻电镜结构解析 Omicron S三聚体的热稳定性
摘要
SARS-CoV-2 Omicron变异株在刺突蛋白中携带超过30个突变，导致对许多治疗性中和抗体的免疫逃逸。我们发现一种靶向受体结合域(RBD)的单克隆抗体35B5对Omicron变异株表现出有效的中和能力。Omicron刺突蛋白胞外域三聚体与35B5 Fab复合物的冷冻电镜结构揭示，Omicron刺突蛋白表现出紧密的三聚体堆积和高热稳定性，以及在RBD、N端结构域(NTD)和亚结构域1和2内的显著抗原漂移和结构变化。然而，这些变化不影响对不变的35B5表位的靶向。35B5通过引起保守的N-聚糖开关内的显著构象变化来有效中和SARS-CoV-2 Omicron和其他变异株，该开关控制RBD从“向下”状态到“向上”状态的转变，从而允许识别宿主进入受体ACE2。35B5的这种作用模式及其有效的中和能力表明其具有治疗SARS-CoV-2的潜在应用价值。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 尽管Omicron变异株的刺突蛋白发生显著抗原漂移和结构变化，35B5抗体如何维持对Omicron的有效中和能力？
- 核心机制
- 35B5通过靶向RBD上不变的保守表位，导致保守N-聚糖开关从RBD上被置换，使RBD的“向上”状态不稳定，最终导致S三聚体解离，从而中和病毒。
- 主要证据
- 通过ELISA、假病毒及活病毒中和实验证明35B5的纳摩尔级中和活性；冷冻电镜结构显示35B5与RBD结合并引起N165和N234聚糖的位移。
- 研究意义
- 35B5的有效中和能力和高抗原漂移耐受性使其成为临床治疗的候选抗体，其特定表位可能用于开发针对SARS-CoV-2变异株的通用疫苗。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
解析Omicron S-ECD与35B5 Fab的复合物结构
确定35B5与Omicron S-ECD结合的分子细节和结构变化。
使用冷冻电镜单颗粒方法解析Omicron S-ECD与35B5 Fab复合物的结构，并进行局部 refinement 以获得界面密度图。
分析Omicron S蛋白的结构变化和抗原漂移
理解Omicron突变对S蛋白结构、稳定性和抗原性的影响。
通过结构比对和序列分析，分析Omicron突变位点的结构变化、表面静电分布变化，以及与已知抗体表位的关系。
验证35B5表位的保守性及其功能
确认35B5表位在变异株中的保守性，并揭示其功能重要性。
进行序列保守性分析，并分析表位残基与N-聚糖的相互作用，通过结构比较揭示35B5结合导致N-聚糖位移的机制。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 抗体生产 | ExpiCHO表达系统试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | A29133 |
| ELISA检测 | 辣根过氧化物酶标记的山羊抗人IgG抗体 | Bioss Biotech | bs-0297G-HRP |
| 中和实验检测 | 双荧光素酶报告基因检测系统试剂盒 | Promega | E1910 |
| 细胞培养 | HEK293F细胞 | Thermo Fisher Scientific | 11625019 |
| SMM 293-TI培养基 | Sino Biological | M293TI | |
| ExpiCHO-S细胞 | Thermo Fisher Scientific | A29133 | |
| VeroE6-TMPRSS2细胞 | JCRB | JCRB1819 | |
| 蛋白表达转染 | 聚乙烯亚胺 | Polysciences | 24765-1 |
| 蛋白消化 | 木瓜蛋白酶 | Worthington Biochemical Corporation | LS003119 |
| ELISA抗原 | SARS-CoV-2野生型S三聚体蛋白 | Acro Biosystems | SPN-C52H7 |
| SARS-CoV-2 Delta S蛋白 | Sino Biological | 40589-V08H10 | |
| SARS-CoV-2 Omicron S蛋白 | Acro Biosystems | SPN-C52Hz | |
| 热稳定性实验 | SARS-CoV-2 S蛋白(D614G), His标签, HexaPro三聚体 | Acro Biosystems | SPN-C52H3 |
| 假病毒中和实验 | SARS-CoV-2野生型假病毒 | Sino Biological | PSV001 |
| SARS-CoV-2 Delta假病毒 | Sino Biological | PSV011 | |
| SARS-CoV-2 Omicron假病毒 | Sino Biological | PSV016 | |
| 冷冻电镜 | Quantifoil金网(300目,R1.2/1.3) | Quantifoil Micro Tools GmbH | Q62307 |
| 蛋白纯化 | Superose 6 10/300 Increase GL 凝胶过滤柱 | GE Healthcare Life Sciences | 29091596 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 抗体中和活性检测 | 35B5抗体浓度范围；S蛋白包被浓度；假病毒及活病毒滴度；细胞数量；孵育时间及温度 阅读提示：Methods: ELISA、SARS-CoV-2 pseudovirus neutralization、Authentic SARS-CoV-2 Omicron neutralization |
| 冷冻电镜样品制备及结构解析 | Omicron S-ECD与35B5 Fab的比例和孵育时间；Vitrobot参数；数据收集参数；图像处理细节 阅读提示：Methods: Cryo-EM sample preparation and data collection、Cryo-EM image processing |
| 热稳定性分析 | 蛋白浓度；染料浓度；升温程序；测量次数 阅读提示：Methods: Differential scanning fluorimetry |