提取物制备与筛选
获得具有抗氧化活性的TCE提取物组分。
用不同浓度乙醇提取Trichilia catigua树皮，再用不同溶剂萃取，通过比较TM4细胞氧化损伤保护效果，选择50%醇提物的乙酸乙酯部位作为TCE。
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Trichilia catigua A. Juss. 对DEHP诱导的雄性小鼠生殖系统损伤的保护作用。
The Protective Effect of Trichilia catigua A. Juss. on DEHP-Induced Reproductive System Damage in Male Mice.
实验完整度
高包含小鼠体内模型（急性毒性、DEHP诱导损伤、TCE干预），检测了病理、精子参数、激素、酶活性，以及qRT-PCR和IHC的机制验证。
主要模型
雄性ICR小鼠 DEHP诱导的生殖系统损伤小鼠模型 TM4细胞（用于提取物筛选）
重点核对
DEHP诱导剂量：2.5 mg g−1，每日一次，持续7天，灌胃 TCE给药剂量：300、600、900 mg kg−1，灌胃，持续28天 阳性对照：L-肉碱（500 mg kg−1）和维生素E（100 mg kg−1） 样本量：每组12只小鼠 统计：单因素方差分析，p<0.05
摘要
本研究旨在探讨 Trichilia catigua A. Juss. 提取物（TCE）对邻苯二甲酸二（2-乙基己基）酯（DEHP）诱导的小鼠生殖系统损伤的保护作用及其分子机制。急性毒性试验显示，小鼠的最大耐受剂量（MTD）高达2.7 g kg−1。在DEHP诱导后，对小鼠口服给予TCE（L-TCE、M-TCE、H-TCE）28天。各组间指标差异表明，TCE显著改善了肛门生殖器距离以及附睾和睾丸的器官指数。与模型组相比，TCE还显著减少了精索静脉曲张和间质细胞病变。H-TCE降低了精子畸形率，提高了性激素水平、Na+K+和Mg2+、Ca2+-ATPase酶活性、抗氧化酶活力，同时LH和MDA含量显著降低。M-TCE和H-TCE均显著增加了睾丸标志酶ACP和LDH的水平。进一步研究表明，DEHP诱导降低了Nrf2、SOD2、SOD3、CDC25C、CDK1、CYP11A1、3β-HSD、5ɑ-R、AR、SF1和CYP17A1的mRNA表达水平，增加了Keap1的水平，而TCE逆转了这些基因的表达水平。同时，IHC结果表明，与对照组相比，相关蛋白的表达活性发生了显著变化。结果表明，M-TCE和H-TCE通过改善睾丸组织病理学、修复睾丸功能和减少氧化应激损伤，使DEHP诱导的雄性小鼠生殖系统损伤得以恢复。氧化相关的Keap1-Nrf2通路、SODs酶、细胞周期控制相关的CDC25C-CDK1通路以及类固醇生成相关通路可能有助于TCE的这种保护作用。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 探讨Trichilia catigua A. Juss.提取物（TCE）对DEHP诱导的雄性小鼠生殖系统损伤的保护作用及其分子机制。
- 核心机制
- TCE可能通过调节氧化相关的Keap1-Nrf2通路、SODs酶、细胞周期控制相关的CDC25C-CDK1通路以及类固醇生成相关通路发挥保护作用。
- 主要证据
- DEHP诱导后，TCE（特别是M-TCE和H-TCE）改善了睾丸组织病理学、修复了睾丸功能（如恢复激素水平和睾丸标志酶活性），并减轻了氧化应激损伤。qRT-PCR和IHC证实了相关基因和蛋白表达的变化。
- 研究意义
- 本研究初步证实了Trichilia catigua对雄性小鼠生殖的有益作用，其机制可能涉及抗氧化、能量代谢和睾丸功能的调节，为后续深入研究和潜在应用提供了基础。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
急性毒性试验
初步评估TCE的安全性，确定最大耐受剂量（MTD）。
对小鼠灌胃不同剂量的TCE，观察7天，记录毒性反应和死亡情况，计算LD50或MTD。
体内药效实验
评估TCE对DEHP诱导的生殖系统损伤的保护作用。
小鼠先腹腔注射或灌胃DEHP诱导损伤，然后给予不同剂量的TCE或阳性对照，持续28天，检测生殖器官指数、精子参数、病理等。
组织病理学分析
评估睾丸组织的形态学变化。
取睾丸组织，固定、包埋、切片，进行HE染色，观察生精上皮结构、精索静脉曲张、间质细胞病变等。
精子分析
评估TCE对精子数量和质量的影响。
取附睾制备精子悬液，计数精子总数，计算精子畸形率。
生化指标检测
评估TCE对激素水平、睾丸标志酶、ATPase和氧化应激指标的影响。
检测血清性激素（T、LH、FSH、E2），睾丸组织匀浆中的AKP、ACP、LDH、ATPase（Na+K+-ATPase等）、SOD、MDA、GSH-Px、GSH、GR、CAT等。
基因表达分析
检测TCE对氧化、细胞周期和类固醇生成相关基因mRNA表达的影响。
提取睾丸组织总RNA，逆转录，进行qRT-PCR，检测相关基因表达。
蛋白表达分析
验证TCE对相关蛋白表达的影响。
通过免疫组化（IHC）检测睾丸组织中Nrf2、Keap1、SOD2、SOD3、CDC25C、CDK1蛋白的表达和分布。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 设备 | AB265-S分析天平 | METTLER TOLEDO | -- |
| BCD-206TS海尔冰箱 | Haier | -- | |
| DZKW-4电子恒温水浴锅 | Linmao Technology | -- | |
| FJ-200高速分散匀浆机 | Shanghai Specimen Model Factory | -- | |
| NanoDrop 2000分光光度计 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| LightCycler® 480实时荧光定量PCR仪 | Roche | -- | |
| 生物显微镜 | Nikon | -- | |
| MDF-U53V超低温冰箱 | SANYO | -- | |
| 试剂 | 福林酚 | Solarbio | F8060 |
| 没食子酸 | Shanghai Winherb Medical Technology | 151017 | |
| 邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯 | Alfa Aesar | A10415 | |
| 抗氧化检测 | 超氧化物歧化酶活性检测试剂盒 | Nanjing Jiancheng | A001 |
| 丙二醛检测试剂盒 | Nanjing Jiancheng | A003 | |
| 过氧化氢酶检测试剂盒 | Nanjing Jiancheng | A007 | |
| 还原型谷胱甘肽检测试剂盒 | Nanjing Jiancheng | A006 | |
| 谷胱甘肽还原酶检测试剂盒 | Nanjing Jiancheng | A062 | |
| 谷胱甘肽过氧化物酶检测试剂盒 | Nanjing Jiancheng | A005 | |
| 生化检测 | 琥珀酸脱氢酶检测试剂盒 | Nanjing Jiancheng | A022 |
| 酸性磷酸酶检测试剂盒 | Nanjing Jiancheng | A060 | |
| 乳酸脱氢酶检测试剂盒 | Nanjing Jiancheng | A020 | |
| 碱性磷酸酶检测试剂盒 | Nanjing Jiancheng | A059 | |
| 激素检测 | 小鼠促卵泡激素ELISA试剂盒 | Mlbio | ml001910 |
| 小鼠雌二醇ELISA试剂盒 | Mlbio | ml001962 | |
| 小鼠睾酮ELISA试剂盒 | Mlbio | ml001948 | |
| 小鼠促黄体生成素ELISA试剂盒 | Mlbio | ml001948 | |
| 分子生物学 | RNAiso Plus 总RNA提取试剂 | TaKaRa Bio | 9108-9109 |
| PrimeScript RT Master Mix 逆转录试剂 | TaKaRa Bio | DRR036A | |
| TB Green Premix Ex Taq 实时荧光定量PCR试剂 | TaKaRa Bio | RR820WR | |
| 免疫组化 | 抗KEAP1抗体 | Bioss | bs-3648R |
| 抗Nrf2抗体 | Bioss | bs-1074R | |
| 抗CDC25C抗体 | Bioss | bs-9597R | |
| 抗SOD2抗体 | Bioss | bs-20667R | |
| 抗SOD3抗体 | Bioss | bs-3895R | |
| 抗CDK1抗体 | Bioss | bs-1341R |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物分组与给药 | DEHP剂量：2.5 mg g−1，每日，7天；TCE剂量：300、600、900 mg kg−1；给药方式：灌胃；治疗持续时间：28天；阳性对照：L-肉碱（500 mg kg−1）和维生素E（100 mg kg−1）；样本量：每组12只 阅读提示：Materials and Methods, Animal Grouping and Dosing |
| 精子分析 | 精子悬挂制备：附睾置于37°C生理盐水1 min；精子计数方法：使用血细胞计数板，计数5个方格；精子畸形率：染色，计数1000个精子 阅读提示：Materials and Methods, Determination of Sperm Count and Sperm Abnormality Rate |
| 生化指标检测 | 血清制备：离心3500rpm，10分钟；检测方法：按照试剂盒说明书；组织匀浆：使用液氮保存的睾丸组织 阅读提示：Materials and Methods, Determination of Sex Hormones and other assays |
| qRT-PCR | RNA提取：RNAiso Plus；cDNA合成：PrimeScript RT Master Mix；qPCR：TB Green Premix Ex Taq，LightCycler 480系统；内参基因：GAPDH 阅读提示：Materials and Methods, qRT-PCR Detection of Gene Expression |
| 免疫组化 | 抗体信息：抗KEAP1、Nrf2、CDC25C、SOD2、SOD3、CDK1，稀释比例分别为1:400, 1:400, 1:200, 1:300, 1:300, 1:300；切片厚度：5 µm；DAB显色 阅读提示：Materials and Methods, IHC Studies and Table 2 |