circRNA测序及差异表达分析
鉴定与优质笔毛形成相关的差异表达circRNA
对NQ和SQ山羊颈椎皮肤组织进行circRNA测序，筛选差异表达circRNA（FC≥1.5，FDR<0.05），构建circRNA-miRNA互作网络，并进行KEGG通路富集分析。
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环状RNA CircCOL1A1作为miR-149-5p海绵通过CMTM3/AR轴调控优质笔毛的形成
The Circular RNA CircCOL1A1 Functions as a miR-149-5p Sponge to Regulate the Formation of Superior-Quality Brush Hair via the CMTM3/AR Axis.
实验完整度
高研究包含circRNA测序数据分析、细胞功能实验（增殖、凋亡、分化）、双荧光素酶报告基因、RIP实验及组织表达验证等多个独立证据层级，且包含功能及机制验证。
主要模型
山羊毛囊干细胞（gHFSCs） HEK293T细胞 正常品质（NQ）与优质品质（SQ）山羊皮肤组织样本
重点核对
circCOL1A1敲低和过表达对gHFSCs增殖、凋亡、分化的影响 circCOL1A1与miR-149-5p的直接结合及海绵作用 miR-149-5p对CMTM3表达的调控及CMTM3/AR轴的验证 circCOL1A1、miR-149-5p、CMTM3在NQ和SQ山羊皮肤组织中的表达差异
摘要
优质笔毛，也称为III型毛，只能从长江三角洲白山羊皮肤组织的颈椎区域获得。优质笔毛的形成由一系列关键基因和相关信号通路控制。环状RNA（circRNAs）是普遍存在的内源性非编码RNA，调节哺乳动物的许多生物和生理过程。然而，关于circRNAs在优质笔毛形成中的潜在调控作用知之甚少。在此，我们分析了来自正常品质笔毛山羊和优质品质笔毛山羊颈椎区域皮肤组织的circRNA测序数据，然后选择并鉴定了差异表达的circRNA circCOL1A1。为了研究circCOL1A1的调控作用和机制，培养山羊毛囊干细胞（gHFSCs），并用circCOL1A1过表达质粒和小干扰RNA（siRNAs）处理。功能实验表明，circCOL1A1敲低促进体外培养的gHFSCs增殖和分化，但抑制干细胞凋亡，而circCOL1A1过表达抑制干细胞增殖和分化并诱导凋亡。生物信息学分析结合双荧光素酶报告基因实验和RNA结合蛋白免疫沉淀（RIP）验证，机制上，circCOL1A1可直接结合miR-149-5p，然后解除其对CMTM3的抑制作用，进一步控制CMTM3/AR轴。总之，我们的结果揭示了优质笔毛形成的新调控通路，并表明circCOL1A1通过靶向miR-149-5p/CMTM3/AR轴在gHFSC生长和优质笔毛形成中发挥作用。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- circRNA circCOL1A1在优质笔毛形成中的调控作用及分子机制是什么？
- 核心机制
- circCOL1A1作为miR-149-5p的海绵，解除miR-149-5p对CMTM3的抑制作用，进而调控CMTM3/AR轴，抑制毛囊干细胞增殖和分化并促进凋亡，最终抑制优质笔毛的形成。
- 主要证据
- 通过circRNA测序筛选出差异表达的circCOL1A1；在gHFSCs中敲低或过表达circCOL1A1，观察到细胞增殖、凋亡和分化的相应变化；双荧光素酶报告基因和RIP实验证实circCOL1A1与miR-149-5p直接结合；RT-qPCR和Western blot显示circCOL1A1调控miR-149-5p和CMTM3表达。
- 研究意义
- 研究揭示了circCOL1A1/miR-149-5p/CMTM3/AR轴在优质笔毛形成中的新调控机制，为保护长江三角洲白山羊种质资源提供了潜在靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
circCOL1A1的鉴定与特征分析
验证circCOL1A1的真实性、稳定性和亚细胞定位
通过Sanger测序、发散/收敛引物PCR、RNase R处理、放线菌素D处理以及细胞核/质RNA分离实验，验证circCOL1A1的环状结构、稳定性和主要定位。
circCOL1A1对gHFSCs增殖的影响
探究circCOL1A1对毛囊干细胞增殖的调控作用
在gHFSCs中转染circCOL1A1 siRNA或过表达质粒，通过RT-qPCR、Western blot检测增殖标志物（PCNA、CDK1、CCND2），EdU实验和流式细胞术检测细胞周期。
circCOL1A1对gHFSCs凋亡的影响
探究circCOL1A1对毛囊干细胞凋亡的调控作用
在gHFSCs中转染circCOL1A1 siRNA或过表达质粒，通过RT-qPCR、Western blot检测凋亡相关基因（Bcl2、Bax、Caspase3、Caspase9），Annexin V-FITC/PI染色和流式细胞术检测凋亡率。
circCOL1A1对β-catenin诱导的gHFSCs分化的影响
探究circCOL1A1对毛囊干细胞分化的调控作用
通过β-catenin过表达质粒诱导gHFSCs分化，同时转染circCOL1A1 siRNA或过表达质粒，通过RT-qPCR、Western blot和免疫荧光检测分化标志物（β-catenin、C-myc、KRT6）的表达。
circCOL1A1与miR-149-5p的相互作用验证
验证circCOL1A1是否作为miR-149-5p的海绵
通过双荧光素酶报告基因实验（野生型和突变型circCOL1A1载体）、RIP实验（Ago-2抗体）以及RT-qPCR检测miR-149-5p的表达变化，验证circCOL1A1与miR-149-5p的直接结合及海绵作用。
circCOL1A1通过miR-149-5p对gHFSCs增殖和凋亡的救援实验
确认circCOL1A1对细胞增殖和凋亡的影响是否依赖于miR-149-5p
将circCOL1A1-siRNA与miR-149-5p inhibitors共转染，或将circCOL1A1过表达质粒与miR-149-5p mimics共转染，检测增殖标志物、凋亡标志物及细胞周期、凋亡率的变化。
circCOL1A1对CMTM3表达的调控
验证circCOL1A1通过海绵吸附miR-149-5p促进CMTM3表达
在gHFSCs中敲低或过表达circCOL1A1，单独或与miR-149-5p inhibitors/mimics共转染，检测CMTM3的mRNA和蛋白水平，并通过RIP实验验证CMTM3与AR的关联。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
circRNA测序及生物信息学分析
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| circRNA鉴定 | 核糖核酸酶R | Geneseed | -- |
| RNA提取 | TRIzol试剂盒 | Takara | -- |
| 反转录 | Prime-Script RT试剂盒（含gDNA去除） | Takara | -- |
| RT-qPCR | TB Green II预混液试剂盒 | Takara | -- |
| ABI 7500/7500-Fast实时荧光定量PCR系统 | Applied Biosystems | -- | |
| Western blot | RIPA裂解液 | Solarbio | -- |
| BCA蛋白浓度测定试剂盒 | Solarbio | -- | |
| PVDF膜 | Immobilon | -- | |
| 抗PCNA抗体 | Abcam | ab18197 | |
| 抗CDK1抗体 | Abcam | ab32384 | |
| 抗CCND2抗体 | Abcam | ab207604 | |
| 抗Bcl2抗体 | Proteintech | 12789-1-AP | |
| 抗Bax抗体 | Abcam | ab32503 | |
| 抗Caspase3抗体 | Proteintech | 19677-1-AP | |
| 抗Caspase9抗体 | Proteintech | 10380-1-AP | |
| 抗CMTM3抗体 | Bioss | bs-8021R | |
| 抗β-连环蛋白抗体 | Abcam | ab32572 | |
| 抗C-myc抗体 | Abcam | ab32072 | |
| 抗KRT6抗体 | Abcam | ab93279 | |
| 抗β-肌动蛋白抗体 | Abcam | ab8229 | |
| 辣根过氧化物酶标记二抗 | Bioworld | BS13278; | |
| 超敏增强型ECL化学发光试剂 | Biosharp | -- | |
| Bio-Rad ChemiDoc Touch成像系统 | Bio-Rad | -- | |
| 细胞培养 | DMEM-F12培养基 | Gibco | -- |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 青霉素-链霉素 | Invitrogen | -- | |
| 转染 | Lipofectamine 3000转染试剂 | Invitrogen | -- |
| 细胞培养 | Opti-MEM培养基 | Gibco | -- |
| 细胞增殖 | EdU细胞增殖检测试剂盒 | RiboBio | -- |
| 细胞培养 | 6孔板 | Corning | -- |
| 24孔板 | Corning | -- | |
| 细胞周期检测 | 碘化丙啶染色缓冲液 | Beyotime | -- |
| 细胞凋亡检测 | Annexin V-FITC染色缓冲液 | Beyotime | -- |
| 流式分析 | FACSAria SORP流式细胞仪 | BD BioSciences | -- |
| CytExpert v2.3软件 | Beckman Coulter | -- | |
| 双荧光素酶报告基因 | 双荧光素酶报告基因检测试剂盒 | TransGen | -- |
| BioTek Synergy 2多功能酶标仪 | BioTek | -- | |
| psiCHECK-2载体 | Promega | -- | |
| RIP | RNA结合蛋白免疫沉淀试剂盒 | Geneseed | -- |
| 抗Ago-2抗体 | Abcam | -- | |
| IgG抗体 | Millipore | -- | |
| 免疫荧光 | 抗β-连环蛋白免疫荧光抗体 | Abcam | -- |
| 山羊抗兔IgG H&L (Alexa Fluor 488或647) | Abcam | -- | |
| Hoechst-33342染色液 | Beyotime | -- | |
| Leica荧光显微镜 | Leica | -- | |
| 免疫组化 | 生物素标记二抗 | Boster | -- |
| Olympus CX31/CX33显微镜 | Olympus | -- | |
| 统计 | SPSS v24软件 | IBM | -- |
| Origin 7.5软件 | OriginLab | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| circRNA测序及差异表达筛选 | 样本数量、差异表达阈值（FC≥1.5，FDR<0.05）、数据处理流程 阅读提示：Methods部分‘Sample Collection and Ethics Statement’和‘CircRNA-miRNA Interaction Network Construction and Analysis’，以及Figure 1 legend |
| circCOL1A1鉴定 | RNase R处理条件（3 U/µg, 10min）、放线菌素D浓度（2 μg/ml）、细胞核/质分离方法 阅读提示：Methods部分‘CircRNA Selection and Specificity Identification’，Figure 2 legend |
| 细胞培养与转染 | gHFSCs和HEK293T的培养基成分、转染试剂（Lipofectamine 3000）、转染浓度、转染后培养时间（48h） 阅读提示：Methods部分‘Cell Culture and Transfection’ |
| 细胞增殖和凋亡检测 | EdU检测的细胞密度（1×10^5/well）、细胞周期和凋亡检测的细胞密度（5×10^5/well）、染色试剂和流式细胞仪型号 阅读提示：Methods部分‘Cell Proliferation, Cell Cycle, and Cell Apoptosis Assays’ |
| 双荧光素酶报告基因 | HEK293T细胞密度（1×10^5/well）、共转染的质粒和miRNA oligos的剂量、检测时间（48h后） 阅读提示：Methods部分‘Dual-Luciferase Assay’ |
| RIP实验 | 细胞数量（1×10^7）、抗体使用（Ago-2和IgG）、孵育时间、RT-qPCR检测circCOL1A1和miR-149-5p 阅读提示：Methods部分‘RNA Binding Protein Immunoprecipitation (RIP) Assay’ |