构建BAPN诱导的TAAD小鼠模型并收集样本
建立模拟人类散发性TAAD的机械应力相关小鼠模型，并在疾病进展的不同时间点收集主动脉组织。
给3周龄雄性C57BL/10小鼠每日口服BAPN（0.5 g/kg体重，溶于饮水）持续28天，在给药后第7、14、21天收集升主动脉和主动脉弓组织，同时收集对照（饮水）小鼠组织。
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单细胞RNA测序鉴定Il1rn+/Trem1+巨噬细胞亚群作为缓解胸主动脉瘤和夹层进展的细胞靶点
Single-cell RNA sequencing identifies an Il1rn+/Trem1+ macrophage subpopulation as a cellular target for mitigating the progression of thoracic aortic aneurysm and dissection.
实验完整度
高包含小鼠BAPN诱导模型三个时间点scRNA-seq、人类样本bulk RNA-seq、细胞间通讯分析、功能实验（Ki20227和mLR12处理）及多种验证实验（smFISH、免疫荧光等）。
主要模型
BAPN诱导的TAAD小鼠模型（C57BL/10小鼠） 人胸主动脉组织样本 人CD11b+巨噬细胞/单核细胞
重点核对
BAPN给药剂量：0.5 g/kg体重，每日口服，持续28天 scRNA-seq使用BD Rhapsody平台，细胞捕获和文库制备；测序使用Illumina NovaSeq 6000 Ki20227给药剂量：30 mg/kg，与BAPN同时或第14天开始给药 mLR12给药剂量：5 mg/kg，每日腹腔注射，持续28天 人类样本：TAAD患者（n=8）和健康供体（n=6）的胸主动脉组织用于bulk RNA-seq
摘要
胸主动脉瘤和夹层(TAAD)是一种危及生命的疾病，其特征是胸主动脉中层变性。彻底了解发病过程中的调节变化对于药物治疗的发展至关重要。为了描述TAAD发展过程中的细胞和分子变化，我们对β-氨基丙腈诱导的TAAD小鼠模型的胸主动脉细胞进行了单细胞RNA测序，时间点覆盖从疾病早期到晚期的三个时间点。进行了比较分析以描述细胞组成、谱系特异性调控和细胞间通讯变化的时间动态。应激反应和Toll样受体信号通路的过度激活导致了早期的平滑肌细胞衰老。鉴定出三个主动脉巨噬细胞亚群，即Lyve1+驻留样、Cd74高表达抗原呈递和Il1rn+/Trem1+促炎巨噬细胞。在小鼠和人类中，促炎巨噬细胞亚群被发现是大多数有害分子的主要来源。用Ki20227抑制主动脉中巨噬细胞的积聚可显著降低小鼠TAAD和主动脉破裂的发生率。通过使用mLR12阻断Trem1来靶向Il1rn+/Trem1+巨噬细胞亚群可显著降低小鼠主动脉破裂率。我们首次在单细胞分辨率下对TAAD发展过程中的细胞和分子变化进行了全面分析。我们的结果强调了抗炎治疗在TAAD中的重要性，并确定巨噬细胞亚群是TAAD有害分子的主要来源。通过阻断TREM1靶向IL1RN+/TREM1+巨噬细胞亚群可能是一种有前景的药物治疗方法。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- TAAD发生和发展过程中细胞和分子变化的时间动态，以及炎症和巨噬细胞亚群在其中的作用。
- 核心机制
- 应激反应和Toll样受体信号通路的过度激活导致早期平滑肌细胞衰老；Il1rn+/Trem1+促炎巨噬细胞亚群是大多数有害分子（如MMPs和炎症细胞因子）的主要来源，促进TAAD进展；通过TREM1阻断可减少主动脉破裂。
- 主要证据
- BAPN诱导的TAAD小鼠模型的scRNA-seq鉴定出三个巨噬细胞亚群（Lyve1+、Cd74high、Il1rn+/Trem1+），其中Il1rn+/Trem1+亚群高表达MMP和炎性细胞因子；人类样本bulk RNA-seq显示CD74和IL1RN表达上调；用Ki20227抑制巨噬细胞积累和用mLR12阻断Trem1均显著降低小鼠主动脉破裂率。
- 研究意义
- 本研究首次在单细胞分辨率下全面分析TAAD发展过程中的细胞和分子变化，强调抗炎治疗在TAAD中的重要性，并指出靶向IL1RN+/TREM1+巨噬细胞亚群可能是一种有前景的药物治疗方法。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
单细胞RNA测序分析主动脉细胞异质性
在单细胞水平上鉴定主动脉细胞类型和亚群，并分析随疾病进展的细胞组成变化。
使用BD Rhapsody平台对小鼠主动脉细胞进行scRNA-seq，共获得61,826个细胞，鉴定出7个细胞谱系和24个簇，包括平滑肌细胞、成纤维细胞、内皮细胞、巨噬细胞等。
平滑肌细胞差异通路和基因调控网络分析
鉴定TAAD早期平滑肌细胞中失调的通路和关键调控分子。
通过GSEA分析平滑肌细胞中差异调节的REACTOME通路，发现氧化应激、内质网应激和TLR信号通路上调；通过bigScale2构建基因调控网络，比较BAPN和对照识别关键基因如Txn1、Socs3、Egr1。
细胞间通讯分析
揭示TAAD早期平滑肌细胞与其他细胞谱系之间的受体-配体相互作用变化。
使用CellPhoneDB预测细胞间配体-受体相互作用，发现巨噬细胞与平滑肌细胞之间的TNF和TGF-β信号相互作用在BAPN组中显著增强。
巨噬细胞亚群的分子表征和验证
鉴定和验证主动脉巨噬细胞亚群及其在TAAD中的功能特征。
通过scRNA-seq聚类鉴定出三个巨噬细胞亚群（c10 Lyve1+驻留样，c14 Cd74high抗原呈递，c13 Il1rn+/Trem1+促炎），并用smFISH和人类样本bulk RNA-seq进行验证。
巨噬细胞亚群作为有害分子来源的验证
验证促炎巨噬细胞亚群在TAAD中主要表达有害分子。
分析MMP基因和炎性细胞因子在巨噬细胞亚群中的表达，发现c13亚群高表达MMP和炎性细胞因子；在人类样本中通过bulk RNA-seq发现CD74和IL1RN表达上调。
体内药理学干预验证巨噬细胞作用
评估抑制巨噬细胞积累或阻断Trem1对TAAD进展的影响。
使用Ki20227（M-CSF受体抑制剂）抑制巨噬细胞积累，显著降低TAAD发生率；使用mLR12（TREM1阻断肽）阻断Trem1，显著降低主动脉破裂率。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证细胞功能变化
验证免疫效应
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞解离 | Pierce原代心肌细胞分离试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | 88281 |
| 单细胞捕获和文库制备 | BD Rhapsody系统 | BD Biosciences | -- |
| Calcein AM | Thermo Fisher Scientific | C1430 | |
| DRAQ7 | Thermo Fisher Scientific | 564904 | |
| 血细胞计数器适配器 | -- | 633703 | |
| BD Rhapsody卡盒 | BD Biosciences | 400000847 | |
| scRNA-seq测序 | Illumina NovaSeq 6000 | Illumina | -- |
| bulk RNA-seq文库制备 | NEBNext Ultra定向RNA文库制备试剂盒（Illumina） | NEB | -- |
| bulk RNA-seq测序 | Illumina HiSeq X Ten系统 | Illumina | -- |
| 药物处理 | Ki20227 | DC CHEMICAL | DC7168 |
| mLR12肽 | SBS Genetech | -- | |
| smFISH | RNAscope多重荧光试剂盒v2 | Advanced Cell Diagnostics | 323100 |
| smFISH成像 | 共聚焦显微镜LSM780 | Carl Zeiss | -- |
| Vectra Polaris病理成像系统 | PerkinElmer | -- | |
| 免疫荧光染色 | CD11b抗体 | Abcam | ab8878 |
| Trem1抗体 | Bioss | bs-4886R | |
| TREM1抗体 | R&D | AF1278 | |
| 大鼠IgG2b同型对照 | Abcam | ab18536 | |
| 山羊IgG对照 | R&D | AB-108-C | |
| 兔IgG同型对照 | Bioss | bs-0295P | |
| 山羊抗大鼠IgG H&L（Alexa Fluor 488） | Abcam | ab150157 | |
| Alexa Fluor 594标记的山羊抗兔IgG（H+L） | ZSGB-Bio | ZF-0516 | |
| Alexa Fluor 594标记的兔抗山羊IgG（H+L） | ZSGB-Bio | ZF-0517 | |
| ELISA | 小鼠/大鼠TREM1 Quantikine ELISA试剂盒 | R&D Systems | MTRM10 |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Invitrogen | 15596018 |
| 弹性蛋白染色 | 弹性蛋白染色试剂盒 | Sigma-Aldrich | HT25A-1KT |
| 免疫荧光染色 | EDTA抗原修复液 | ZSGB-Bio | ZLI-9069 |
| 封闭液 | ZSGB-Bio | ZLI-9022 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| TAAD小鼠模型构建 | BAPN给药剂量（0.5 g/kg体重）、给药途径（饮水）、小鼠品系（C57BL/10）和年龄（3周龄）、诱导持续时间（28天） 阅读提示：Materials and methods - BAPN-induced TAAD mouse model |
| scRNA-seq实验 | 组织解离方法、细胞活力染料浓度、单细胞捕获平台（BD Rhapsody）、测序平台（Illumina NovaSeq 6000）、细胞数量（61,826）和样本合并策略（每个时间点6只小鼠） 阅读提示：Materials and methods - Tissue dissociation, Cell capture, scRNA-seq library preparation and sequencing |
| scRNA-seq数据处理 | 数据过滤参数（线粒体基因比例、基因数、UMI数）、整合方法（CCA）、聚类分辨率（1） 阅读提示：Materials and methods - scRNA-seq data preprocessing, Dimensional reduction and clustering |
| 巨噬细胞亚群鉴定 | 巨噬细胞亚群的标志基因（Lyve1, Cd74, Il1rn, Trem1）、聚类簇编号（c10, c14, c13） 阅读提示：Results - The heterogeneity of macrophages during the development of TAAD |
| 人类样本bulk RNA-seq | 样本量（TAAD患者n=8，健康供体n=6）、组织来源（胸主动脉）、RNA-seq文库制备方法（NEBNext Ultra Directional RNA Library Prep Kit）、测序平台（Illumina HiSeq X Ten）、分析流程（fastp, Kallisto, sleuth） 阅读提示：Materials and methods - Bulk RNA-seq of human samples |
| Ki20227处理实验 | Ki20227剂量（30 mg/kg）、给药途径（口服）、给药时间（从第1天或第14天开始）、对照组（0.05%甲基纤维素） 阅读提示：Materials and methods - Animal treatment with Ki20227 |
| mLR12处理实验 | mLR12剂量（5 mg/kg）、给药途径（腹腔注射）、给药频率（每日）、持续时间（28天）、对照组（生理盐水） 阅读提示：Materials and methods - Animal treatment with Trem1 inhibitory peptide mLR12 |
| qPCR实验 | 内参基因（GAPDH）、生物重复数（3）、RNA提取试剂（TRIzol） 阅读提示：Materials and methods - Quantitative real-time polymerase chain reaction |
| smFISH实验 | 组织固定（4%多聚甲醛）、切片厚度（10 μm）、RNAscope试剂盒（Multiplex Fluorescent Reagent Kit v2）、探针列表 阅读提示：Materials and methods - Single-molecule fluorescent in situ hybridization |
| 免疫荧光染色 | 一抗和二抗的稀释比例（未明确）、孵育时间（一抗4°C过夜，二抗室温40分钟）、定量分析（每个小鼠3张切片，每张切片3个视野） 阅读提示：Materials and methods - Immunofluorescence staining |