TGF-β1功能降低对选定突触蛋白表达和电生理参数的影响:在急性肝性脑病中观察到的变化的意义

The Effect of TGF-β1 Reduced Functionality on the Expression of Selected Synaptic Proteins and Electrophysiological Parameters: Implications of Changes Observed in Acute Hepatic Encephalopathy.

作者信息Mariusz Popek, Bartosz Bobula, Karolina Orzeł-Gajowik, Magdalena Zielińska
PMID35163004
发布时间2022-01-19
DOI10.3390/ijms23031081

实验完整度

高

包含体内动物模型(AOM和anti-TGF-β1小鼠)、体外内皮细胞模型、蛋白表达分析、电生理记录等多层级实验,并进行了功能验证。

主要模型

AOM诱导的急性肝衰竭小鼠模型 TGF-β1中和抗体处理的小鼠模型 RBE-4大鼠脑内皮细胞系 小鼠脑皮层切片

重点核对

TGF-β1活性形式在血清和脑皮层中的水平 突触蛋白在胞质和膜部分的表达分布 血脑屏障通透性及紧密连接蛋白水平 电生理参数(输入输出曲线、LTP)

摘要

血小板减少是急性肝衰竭(ALF)发病机制的一个特征。血小板是转化生长因子1(TGF-β1)的储存库,TGF-β1是一种多效细胞因子,参与维持中枢神经系统稳态等。在此,我们分析了在腹腔内(ip)注射TGF-β1抗体(anti-TGF-β1;1 mg/mL)的小鼠中,TGF-β1活性形式减少对突触蛋白水平和脑电生理的影响。接下来,我们将其与在氧化偶氮甲烷诱导的ALF模型(AOM;100 mM ip)中记录的血小板减少诱导的TGF-β1减少相关联,并阐明了TGF-β1减少对血脑屏障功能的影响。在AOM小鼠大脑中,突触素和突触结合蛋白在胞质部分增加,而在膜部分减少。在anti-TGF-β1小鼠中,两种蛋白在分析的各个部分均减少。相反,在AOM大脑皮层中,突触后蛋白(N-甲基-D-天冬氨酸受体的NR1亚基、突触后密度蛋白95、桥尾蛋白)增加,但在anti-TGF-β1小鼠中仅观察到NR1亚基的选择性代偿性增加。在anti-TGF-β1模型中,突触蛋白水平的改变并未转化为电生理参数的变化。结果表明,在AOM模型中,突触小泡与突触后膜的对接受损。然而,anti-TGF-β1小鼠中突触蛋白水平的变化不影响神经传递,可能不导致AOM小鼠的神经功能缺损。

实验结论

提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。

研究问题
TGF-β1活性降低是否影响突触蛋白的表达和分布以及电生理参数,从而参与急性肝性脑病中谷氨酸能神经传递的损害?
核心机制
TGF-β1信号通路(通过SMAD3磷酸化)的减少可能影响突触囊泡对接过程,导致突触素和突触结合蛋白在膜部分减少,但可能不影响神经传递。
主要证据
在AOM小鼠和anti-TGF-β1小鼠中,检测了TGF-β1水平、突触蛋白表达、血脑屏障通透性和电生理参数,发现突触蛋白分布改变,但anti-TGF-β1小鼠电生理参数未变。
研究意义
研究提示,急性肝衰竭中血小板减少引起的TGF-β1降低可能加重突触蛋白缺陷,但不是神经传递紊乱的关键因素。

研究路径

按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

1

AOM模型的建立和血液参数分析

验证AOM小鼠模型模拟急性肝衰竭的血小板减少和淋巴细胞减少

对小鼠腹腔注射AOM,采集血液进行涂片和细胞计数,分析血小板和淋巴细胞数量。

2

TGF-β1中和抗体模型的建立

模拟TGF-β1活性降低以研究其对突触蛋白的影响

对小鼠腹腔注射抗TGF-β1抗体,检测血清和脑皮层中TGF-β1水平及信号通路。

3

血脑屏障体外模型评估

评估TGF-β1减少对血脑屏障通透性的影响

在RBE-4细胞单层上,使用TGF-β1中和抗体和/或氨处理,测量FITC-dextran通透性,并检测整合素β1 mRNA表达。

4

突触蛋白表达分析

检测TGF-β1减少对突触前和突触后蛋白表达及分布的影响

从小鼠额叶皮层分离胞质和膜部分,免疫印迹检测突触素、突触结合蛋白、VAMP1/2、NR1、PSD-95、gephyrin等蛋白水平。

5

电生理记录

评估TGF-β1减少对皮层突触传递和可塑性的影响

制备脑片,记录场电位,绘制输入输出曲线,并诱导LTP。

研究方法

按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。

产品清单

实验环节名称品牌货号
氧化偶氮甲烷Sigma AldrichA5486
TGF-β1中和抗体R&D SystemsAB-101-NA
最低必需培养基Gibco--
Ham's F-10营养混合物Thermo Fisher Scientific--
胎牛血清Thermo Fisher Scientific--
碱性成纤维细胞生长因子Thermo Fisher Scientific--
庆大霉素Thermo Fisher Scientific--
Transwell插入式培养皿Corning--
氯化铵Sigma Aldrich--
FITC标记的右旋糖酐(40 kDa)Sigma Aldrich--
FLUOstar Omega酶标仪BMG LABTECH--
TRI试剂Sigma-Aldrich--
HighCapacity cDNA逆转录试剂盒Applied Biosystems--
TaqMan基因表达检测Applied BiosystemsMm01178820_m1,
BCA蛋白定量试剂盒Thermo Scientific--
Laemmli缓冲液Sigma AldrichS3401
硝酸纤维素膜Bio-Rad Laboratories1620112
抗突触素抗体Abcamab32127
抗ZO-1抗体Proteintech21773-1-AP
抗occludin抗体Proteintech27260-1-AP
抗桥尾蛋白抗体Proteintech12681-1-AP
抗GABARA1抗体Proteintech12410-1-AP
抗claudin-5抗体Bioss Antibodiesbs-1553R
抗TGF-β1抗体Abcamab9758
抗VAMP-1/2抗体Santa Cruz Biotechnologiessc-20039
抗PSD-95抗体Santa Cruz Biotechnologiessc-2894
抗突触结合蛋白1抗体Santa Cruz Biotechnologiessc-136480
抗NR1抗体Thermo Fisher ScientificPA5-55093
抗磷酸化SMAD3抗体Sigma AldrichSAB4503781
HRP标记的抗兔IgGSigma-AldrichA9917
HRP标记的抗鼠IgGSigma-Aldrich--
GAPDH抗体ProteintechHRP-60004
G-Box成像系统SynGene--
Quantikine ELISA小鼠TGF-b1试剂盒R&D SystemsMB100B
Legend Max Free活性TGF-β1 ELISA试剂盒BioLegend437707
SMAD3 (pS423/S425) ELISA试剂盒Abcamab186038
异氟烷Baxter--
振动切片机Leica--
刺激电极FHC, Inc.--
Micro1401接口Cambridge Electronic Design--
Signal 2软件Cambridge Electronic Design--
GraphPad Prism 7软件GraphPad Software--

关键环节

汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

环节核对要点
动物模型建立
小鼠品系、体重、AOM剂量、anti-TGF-β1剂量、处理时间
阅读提示:Materials and Methods: 4.1 Animal Models
TGF-β1水平测定
血清和脑组织处理方式、ELISA试剂盒、激活步骤、稀释倍数
阅读提示:Materials and Methods: 4.4 TGF-β1 Level Determination
内皮细胞通透性实验
RBE-4细胞培养条件、Transwell规格、氨和抗体浓度、FITC-dextran浓度、孵育时间
阅读提示:Materials and Methods: 4.5, 4.6
突触蛋白表达分析
脑组织匀浆和分级离心条件、抗体稀释度、上样量、内参蛋白
阅读提示:Materials and Methods: 4.8 Immunoblotting Analyses
电生理记录
脑片制备、ACSF成分、刺激参数、LTP诱导协议
阅读提示:Materials and Methods: 4.9 Electrophysiological Analysis