建立小鼠卒中模型
模拟缺血性和出血性卒中，观察胶质细胞反应
采用大脑中动脉闭塞（MCAO）诱导缺血性卒中，胶原酶IV注射诱导出血性卒中，于术后不同时间点（1、3、7、14天）进行检测。
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小鼠反应性胶质增生介导的卒中亚型依赖性突触消除
Stroke subtype-dependent synapse elimination by reactive gliosis in mice.
实验完整度
高研究包含体外细胞模型、小鼠卒中模型、条件性基因敲除、免疫组化、电镜、行为学及单细胞测序等多层级实验，并进行了功能与机制验证。
主要模型
小鼠缺血性卒中模型（MCAO） 小鼠出血性卒中模型（胶原酶诱导） 小胶质细胞/巨噬细胞特异性MEGF10/MERTK敲除小鼠 星形胶质细胞特异性MEGF10/MERTK敲除小鼠
重点核对
缺血性和出血性卒中模型的诱导方式及损伤程度 MEGF10和MERTK在细胞类型特异性敲除的验证 吞噬受体MEGF10和MERTK的表达水平及时间变化 突触吞噬的检测方法（免疫荧光、电镜、吞噬传感器） 行为学测试的时间点和统计方法
摘要
反应性胶质增生在中枢神经系统修复中的病理作用仍存在争议。在本研究中，利用小鼠缺血性和出血性卒中模型，我们证明了小胶质细胞/巨噬细胞和星形胶质细胞在反应性胶质增生区域差异性参与吞噬突触。通过特异性删除MEGF10和MERTK吞噬受体，我们确定在缺血性卒中中抑制小胶质细胞/巨噬细胞或星形胶质细胞的吞噬作用可改善神经行为学结果并减轻脑损伤。在出血性卒中中，抑制小胶质细胞/巨噬细胞的吞噬作用而非星形胶质细胞的吞噬作用可改善神经行为学结果。单细胞RNA测序揭示，与缺血性脑相比，出血性脑星形胶质细胞中吞噬作用相关的生物学过程和通路下调。总之，这些发现表明反应性小胶质增生和星形胶质增生在病理学上不同的小鼠卒中模型中各自介导突触吞噬，预防这一过程可能挽救突触丢失。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 在卒中后修复和重塑阶段，反应性胶质增生是否介导突触吞噬，以及这种吞噬是否具有卒中亚型依赖性？
- 核心机制
- 反应性小胶质细胞/巨噬细胞和星形胶质细胞通过MEGF10和MERTK通路吞噬突触；在缺血性卒中中两者均参与，而在出血性卒中中主要是小胶质细胞/巨噬细胞，星形胶质细胞作用有限。
- 主要证据
- 通过条件性敲除MEGF10或MERTK，在缺血性卒中中抑制小胶质细胞/巨噬细胞或星形胶质细胞吞噬可改善神经行为并减少脑萎缩，而在出血性卒中中仅抑制小胶质细胞/巨噬细胞有效。免疫荧光和电镜显示缺血性卒中两种胶质细胞均吞噬突触，出血性卒中则主要在巨噬细胞中。
- 研究意义
- 研究提示抑制胶质细胞介导的突触吞噬可能作为卒中治疗策略，且该策略需根据卒中亚型定制。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
检测胶质细胞吞噬突触
验证反应性胶质细胞是否吞噬突触
通过免疫荧光染色共标记胶质细胞标记物（Iba-1、GFAP）和突触标记物（SYP、Homer-1），并使用透射电镜观察吞噬的突触结构；同时使用吞噬传感器AAV（hsyn-Gephyrin-mCherry-eGFP和hsyn-PSD95-mCherry-eGFP）区分吞噬的兴奋性和抑制性突触。
验证MEGF10和MERTK介导的吞噬作用
在缺血性和出血性卒中中，测试MEGF10和MERTK是否介导胶质细胞吞噬
使用小胶质细胞/巨噬细胞特异性（CX3CR1-CreERT2）和星形胶质细胞特异性（Aldh1l1-CreERT2）MEGF10或MERTK条件性敲除小鼠，通过免疫荧光、Western blot、TEM评估突触吞噬和突触密度。
评估突触后结构变化
检测敲除胶质细胞吞噬受体后对树突棘的影响
通过高尔基染色（Golgi-Cox staining）分析神经元树突棘的形态和密度。
评估脑损伤和神经行为
探究抑制吞噬对脑损伤和神经功能恢复的影响
通过甲酚紫染色测量脑萎缩体积（缺血性）或脑室体积（出血性），并通过神经行为学测试评估功能恢复。
单细胞转录组分析
探索缺血性和出血性卒中星形胶质细胞吞噬能力差异的分子机制
对健康、缺血和出血小鼠的纹状体进行单细胞RNA测序，比较星形胶质细胞亚群的转录谱，重点分析吞噬相关基因和通路。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 动物模型-麻醉 | 异氟烷 | -- | -- |
| MCAO模型-手术材料 | 硅胶包被缝合线 | Covidien | -- |
| 硅胶 | Heraeus Kulzer | -- | |
| 激光多普勒监测 | 激光多普勒血流仪 | Moor Instruments | -- |
| 脑出血模型-立体定位 | 立体定位仪 | RWD Life Science | -- |
| 脑出血模型-胶原酶 | IV型胶原酶 | Sigma-Aldrich | -- |
| 脑出血模型-微量泵 | 微量注射泵 | WPI | -- |
| 免疫染色-封闭 | 牛血清白蛋白 | Gbico | -- |
| 免疫染色-一抗 | 抗Iba-1抗体 | Novusbio | NB100-1028 |
| 抗GFAP抗体 | Abcam | ab53554 | |
| 抗SYP抗体 | Abcam | ab52636 | |
| 抗Homer-1抗体 | Abcam | ab184955 | |
| 抗MERTK抗体 | eBioscience | ebio-14-5751-82 | |
| 抗MEGF10抗体 | Millipore | ABC10 | |
| 抗Mac-2抗体 | Cedarlane | CL8942AP | |
| 抗P2RY12抗体 | BioLegend | 848002 | |
| 抗F4/80抗体 | Abcam | ab6640 | |
| 抗LAMP2抗体 | Millipore | mabc40 | |
| 抗CD31抗体 | R&D | AF3628 | |
| 抗MAP2抗体 | Millipore | MAB3418 | |
| 抗MBP抗体 | Abcam | ab-7349 | |
| 抗SMI32抗体 | BioLegend | 801701 | |
| 免疫染色-二抗 | Alexa Fluor 488偶联二抗 | Invitrogen | -- |
| Alexa Fluor 594偶联二抗 | Invitrogen | -- | |
| Alexa Fluor 647偶联二抗 | Invitrogen | -- | |
| 细胞凋亡检测 | TUNEL凋亡检测试剂盒 | Meilun | MA0224-2 |
| 免疫染色-核染色 | DAPI | Life Technologies | -- |
| 封片 | 封片剂 | Vector Labs | -- |
| FISH检测 | MEGF10和MERTK的生物素标记核糖探针 | GenePharma | -- |
| 蛋白酶K | -- | -- | |
| 链霉亲和素-Cy3 | -- | -- | |
| 抗Iba-1抗体 | Novusbio | NB100-1028 | |
| 抗GFAP抗体 | Abcam | ab53554 | |
| 二抗A11055 | Invitrogen | A11055 | |
| Western blot-一抗 | 抗MEGF10抗体 | ABclonal | A10508 |
| 抗MERTK抗体 | R&D | AF591 | |
| 抗SYP抗体 | Abcam | ab52636 | |
| 抗Homer-1抗体 | Abcam | ab184955 | |
| 抗β-肌动蛋白抗体 | Invitrogen | MA5-15739 | |
| Western blot-二抗 | 辣根过氧化物酶偶联的抗兔或抗鼠IgG | Invitrogen | -- |
| Western blot-显影 | 增强化学发光底物 | Meilunbio | -- |
| Western blot-成像 | ImageJ软件 | NIH | -- |
| qPCR-RNA提取 | TRIzol试剂 | Invitrogen | -- |
| qPCR-浓度测定 | 分光光度计NanoDrop 1000 | Thermo Fisher | -- |
| qPCR-逆转录 | cDNA合成SuperMix试剂盒 | Yeason | 11123ES60 |
| qPCR-实时PCR | SYBR Green预混液 | Yeason | 11203ES08 |
| Golgi染色 | FD快速高尔基染色试剂盒 | FD NeuroTechnologies | -- |
| Golgi染色-切片 | 滑动切片机 | Leica | -- |
| Golgi染色-载玻片 | 显微镜载玻片 | LabScientific | -- |
| Golgi染色-图像分析 | RECONSTRUCT软件 | -- | -- |
| 免疫电镜-切片 | 振动切片机VT-1200S | Leica | -- |
| 免疫电镜-DAB染色 | DAB试剂盒 | Absin | abs957 |
| 免疫电镜-一抗 | 抗Iba-1抗体 | WAKO | -- |
| 抗GFAP抗体 | Millipore | -- | |
| IgG染色 | Histostain™ Plus试剂盒 | Bioss | SP-0022 |
| IgG染色-二抗 | 生物素化山羊抗小鼠IgG | Bioss | -- |
| IgG染色-显色 | DAB染色 | Vector Labs | -- |
| 行为学-步进被动回避测试 | 智能笼 | AfaSci | -- |
| 行为学-数据分析 | CageScore 2.6 | -- | -- |
| 病毒注射 | 腺相关病毒（血清型2/9） | OBiO Technology | -- |
| pAAV-hSyn-PSD95-mCherry-egfp-CW3SL | -- | -- | |
| pAAV-hsyn-Gephyrin-mCherry-eGFP | -- | -- | |
| 病毒注射-麻醉 | 异氟烷 | -- | -- |
| 病毒注射-立体定位 | 立体定位仪 | RWD | -- |
| 病毒注射-微量泵 | 微量注射泵 | WPI | -- |
| 单细胞测序-组织解离 | 成年脑组织解离试剂盒 | Miltenyi Biotec | -- |
| 单细胞测序-建库 | Chromium单细胞控制器 | 10X Genomics | -- |
| 单细胞测序-cDNA纯化 | DynaBeads Myone Silane Beads | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 单细胞测序-测序平台 | HiSeq X Ten平台 | Illumina | -- |
| 图像获取-共聚焦显微镜 | 共聚焦显微镜 | Leica | -- |
| 图像分析 | LAS AF Lite | Leica | -- |
| Imaris | Bitplane | 9.0.3 | |
| DIANA插件 | -- | -- | |
| 电镜观察 | 透射电子显微镜 Tecnai G2 spirit Biotwin | Tecnai | -- |
| 统计软件 | Prism 7.0 | Graphpad | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 建立卒中模型 | MCAO和胶原酶诱导的ICH模型的诱导过程、损伤程度、小鼠品系和年龄、麻醉和手术细节 阅读提示：Methods中A mouse model of middle cerebral artery occlusion和Collagenase-induced intracerebral hemorrhage部分 |
| 基因敲除 | MEGF10和MERTK条件性敲除小鼠的构建、Cre重组酶的类型、他莫昔芬给药方案（剂量、频率、途径） 阅读提示：Methods中Generation of loxp floxed MEGF10 and MERTK mice部分 |
| 突触吞噬检测 | 免疫荧光抗体（Iba-1、GFAP、SYP、Homer-1）的稀释度、共聚焦显微镜参数（z-stack厚度）、吞噬传感器的使用（AAV注射时间、滴度） 阅读提示：Methods中Immunostaining和Virus production and injection部分，以及图1、2图注 |
| MEGF10和MERTK表达分析 | Western blot抗体（MEGF10、MERTK）稀释度、免疫荧光和FISH探针序列 阅读提示：Methods中Western blotting和Fluorescence in situ hybridization部分，以及图4图注 |
| 行为学评估 | mNSS评分、转棒测试（转速加速参数）、步进被动回避测试（训练条件）、网格行走测试（网格尺寸） 阅读提示：Methods中Neurobehavioral tests部分，以及图9图注 |
| 单细胞RNA测序 | 组织解离、细胞计数、测序平台、数据分析参数（聚类算法、差异表达阈值、批次校正） 阅读提示：Methods中Single-cell RNA sequencing和Bioinformatic analysis部分 |