构建角膜缘干细胞特异性METTL3敲除小鼠模型
研究METTL3在角膜缘干细胞中的功能
将Mettl3fl/fl小鼠与K14CreER小鼠杂交获得K14creER/Mettl3fl/fl（cKO）小鼠，并通过他莫昔芬注射诱导敲除。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
METTL3介导的m6A RNA修饰调控角膜损伤修复
METTL3-Mediated m6A RNA Modification Regulates Corneal Injury Repair.
实验完整度
高包含体内基因敲除小鼠模型、碱烧伤损伤模型、RNA-seq和MeRIP-seq组学分析、体外细胞实验及多种组织学染色验证，具有多个独立证据层级。
主要模型
角膜缘干细胞特异性METTL3敲除小鼠（K14CreER/Mettl3fl/fl） 碱烧伤小鼠模型 HCES3细胞系
重点核对
角膜缘干细胞特异性METTL3敲除小鼠模型（K14CreER/Mettl3fl/fl） 碱烧伤模型：1 mol/L NaOH处理角膜中心15秒 METTL3敲除后检测角膜荧光素染色评分 HCES3细胞中shMETTL3敲低METTL3 m6A靶点AHNAK和DDIT4的表达验证
摘要
角膜缘干细胞对于角膜的持续再生和损伤修复至关重要。METTL3催化的N6-甲基腺苷（m6A）mRNA修饰参与许多生物过程，并在干细胞再生中发挥特定作用，而m6A修饰在角膜损伤修复中的作用仍不清楚。在本研究中，我们构建了角膜缘干细胞特异性METTL3敲除小鼠模型，并研究了m6A在修复碱烧伤引起的角膜损伤中的作用。结果表明，角膜缘干细胞中METTL3敲除促进体内细胞增殖和迁移，导致角膜损伤的快速修复。此外，m6A修饰谱分析确定了干细胞调控因子AHNAK和DDIT4为m6A靶点。我们的研究揭示了m6A RNA修饰在调控损伤修复中的重要作用，并为角膜疾病的临床治疗提供了新的见解。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- METTL3介导的m6A RNA修饰在角膜损伤修复中扮演什么角色？
- 核心机制
- METTL3通过m6A修饰调控AHNAK和DDIT4的表达，影响角膜缘干细胞的增殖和迁移，从而影响角膜损伤修复。
- 主要证据
- 在角膜缘干细胞特异性METTL3敲除小鼠中，METTL3缺失促进角膜损伤修复；RNA-seq和MeRIP-seq鉴定AHNAK和DDIT4为m6A靶点，Western blot和RT-qPCR验证其在METTL3敲低后下调。
- 研究意义
- 揭示了m6A RNA修饰在角膜损伤修复中的关键作用，为角膜疾病的临床治疗提供了新的策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
建立碱烧伤角膜损伤模型
模拟角膜损伤并评估METTL3敲除对修复的影响
对cKO和WT小鼠进行角膜碱烧伤处理，并在不同时间点收集样本。
评估角膜损伤修复程度
比较METTL3敲除对损伤修复速度的影响
使用角膜荧光素钠染色评分、H&E染色、免疫荧光染色（Ki67、K14、K10、K1、CD31）和PAS染色评估角膜上皮修复、细胞增殖、迁移和新生血管情况。
鉴定m6A靶基因
寻找METTL3调控的下游靶基因
在HCES3细胞中敲低METTL3（shMETTL3），进行RNA-seq和MeRIP-seq分析，鉴定差异表达基因和m6A修饰峰，并通过Western blot和RT-qPCR验证。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 免疫荧光染色 | 兔抗METTL3抗体 | Abcam | ab195352 |
| 小鼠抗细胞角蛋白14抗体 | Abcam | ab7800 | |
| 小鼠抗Ki67抗体 | Therm | -- | |
| 兔抗细胞角蛋白10抗体 | Abcam | ab76318 | |
| 抗细胞角蛋白5抗体 | Abcam | ab53121 | |
| 抗细胞角蛋白1抗体 | Abcam | ab93652 | |
| 抗CD31抗体 | Bioss | bs-20322R | |
| PAS染色 | PAS染色试剂盒 | Xiangbo | G1008-100 |
| H&E染色 | H&E染色试剂盒 | Solarbio | G1120-100 |
| 免疫组织化学 | 免疫组织化学试剂盒 | Boster | SA102 |
| 冷冻切片包埋 | OCT冷冻切片包埋剂 | OCT | 4583 |
| Western blot | AHNAK抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-390743 |
| REDD1抗体 | Proteintech | 10638-1-AP | |
| GAPDH抗体 | Proteintech | 60004-1-Ig | |
| 免疫荧光染色 | DAPI | Beyotime | -- |
| 免疫荧光显微镜观察 | 荧光显微镜 | Olympus | BX51 |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | -- | -- |
| RNA质量检测 | NanoPhotometer分光光度计 | -- | -- |
| Agilent 2100生物分析仪 | Agilent | -- | |
| RNA-seq文库构建 | NEBNext Ultra RNA文库制备试剂盒 | Illumina | -- |
| RNA-seq文库定量 | Qubit2.0荧光计 | -- | -- |
| RT-qPCR | Roche 11483188001试剂盒 | Roche | 11483188001 |
| KiCqStart SYBR Green qPCR预混液 | -- | -- | |
| ECO实时荧光定量PCR仪 | Illumina | -- | |
| Western blot | PVDF膜 | Immobilon | -- |
| ECL检测试剂盒 | Immobilon | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物模型构建 | 小鼠品系：K14creER/Mettl3fl/fl；他莫昔芬注射方案；小鼠月龄（2-3个月） 阅读提示：Materials and Methods, Section 2.2 |
| 碱烧伤模型 | NaOH浓度（1 mol/L）；滤纸直径（2 mm）；碱烧伤时间（15秒）；冲洗时间（10分钟） 阅读提示：Materials and Methods, Section 2.3 |
| 损伤修复评估 | 荧光素钠染色评分标准；观察时间点（24小时、7天、14天、35天、56天）；样本量（n=6） 阅读提示：Materials and Methods, Section 2.4, 2.5 |
| 细胞实验 | HCES3细胞系；shMETTL3敲低方法；METTL3敲低效率验证 阅读提示：Materials and Methods, Section 2.8, 2.10, 2.11; Figure 4 |
| 组学分析 | RNA-seq和MeRIP-seq的比对参数；m6A peak calling方法；差异基因筛选标准 阅读提示：Materials and Methods, Section 2.8, 2.9 |