构建ACADSB基因敲除细胞系
利用CRISPR/Cas9技术在bMECs中敲除ACADSB基因，建立ACADSB−/−细胞模型。
设计针对ACADSB外显子5的sgRNA，克隆到PX458载体，转染bMECs，通过流式分选单细胞，培养并鉴定敲除细胞系。
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短/支链酰辅酶A脱氢酶敲除牛乳腺上皮细胞的转录组分析揭示其对脂质代谢的调控作用
Transcriptomic Analysis of Short/Branched-Chain Acyl-Coenzyme a Dehydrogenase Knocked Out bMECs Revealed Its Regulatory Effect on Lipid Metabolism.
实验完整度
高包含CRISPR/Cas9基因敲除、RNA-seq转录组分析、RT2 PCR阵列验证、脂质含量测定等多个独立证据层级，并进行了功能验证。
主要模型
牛乳腺上皮细胞（bMECs） ACADSB敲除bMECs（ACADSB−/− bMECs）
重点核对
CRISPR/Cas9敲除目标外显子5，验证gRNA序列和突变 qPCR和Western blot确认ACADSB mRNA和蛋白水平显著降低 RNA-seq分析鉴定差异表达基因（1548个DEGs） RT2 Profiler PCR阵列验证脂质代谢相关基因表达变化 脂质含量测定：CHOL、TG、FFA含量均显著降低
摘要
酰基辅酶A脱氢酶家族包括短/支链酰辅酶A脱氢酶（ACADSB），其催化脂肪酸代谢中酰基辅酶A衍生物的脱氢反应。我们先前的研究通过比较产高脂和低脂牛奶的中国荷斯坦奶牛乳腺上皮细胞（bMECs）的转录组以及细胞水平上的基因功能验证研究，表明ACADSB是影响乳脂合成的关键候选基因。在本研究中，使用CRISPR/Cas9系统敲除了bMECs中的ACADSB基因，并进一步对mRNA转录组进行测序，以验证ACADSB基因的功能并分析其与脂质代谢的相关性。结果显示，共表达15693个基因，1548个基因是差异表达基因（DEGs），富集了6098个GO条目，其中637个GO条目显著增强，如磷脂转运ATP酶活性（GO:0004012）、脂蛋白脂肪酶活性（GO:0004465）、酰基辅酶A脱饱和酶活性（GO:0016215）等。KEGG分析显示，DEGs分布于247条通路中，其中49条显著富集，包括脂肪酸代谢（PATH:01212）、甘油酯代谢（PATH:00561）和脂肪细胞因子信号通路（PATH:04920）。当ACADSB基因被敲除时，bMECs中的CHOL、TGs和FFA含量降低。RT2 Profiler PCR阵列还显示，ACADSB基因的缺失改变了参与脂质代谢的功能基因的表达水平，包括ACADL、ACOX2、ACAT2和FABP3。总之，目前的研究结果表明，ACADSB是bMECs中脂质代谢的关键调节因子。ACADSB−/− bMECs也可作为未来研究脂质和脂肪酸代谢相关基因功能的有用遗传材料和工具。这对于揭示乳脂合成中的基因调控作用和分子机制将是有价值的。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- ACADSB基因在bMECs中是否调控脂质代谢及其分子机制。
- 核心机制
- ACADSB通过调控脂质代谢相关基因（如ACADL、ACOX2、ACAT2、FABP3）的表达，影响FFA、TGs和CHOL的代谢。
- 主要证据
- CRISPR/Cas9敲除bMECs后，CHOL、TG和FFA含量降低，RNA-seq和RT2 PCR阵列显示相关基因表达改变，GO和KEGG富集分析揭示脂质代谢通路显著富集。
- 研究意义
- ACADSB是bMECs中脂质代谢的关键调节因子，ACADSB−/− bMECs可作为研究脂质代谢基因功能的有用遗传材料和工具，有助于揭示乳脂合成的调控机制。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证敲除效率
确认ACADSB基因在mRNA和蛋白水平上的敲除效果。
提取基因组DNA进行PCR和测序验证突变，提取RNA和蛋白质分别进行qPCR和Western blot检测ACADSB表达。
脂质含量测定
检测ACADSB敲除对bMECs中胆固醇、甘油三酯和游离脂肪酸含量的影响。
使用商业试剂盒分别测定CHOL、TG和FFA含量，并用微板阅读器测量。
转录组测序及差异表达分析
揭示ACADSB敲除后全基因组表达变化，鉴定差异表达基因。
提取RNA构建cDNA文库进行RNA-seq，使用EBSeq算法鉴定DEGs，进行GO和KEGG富集分析。
RT2 Profiler PCR阵列验证
验证差异表达的脂质代谢相关基因表达变化。
使用RT2 Profiler PCR阵列检测脂质代谢通路基因的表达，以多个看家基因作为参照。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM/F12培养基 | HyClone | -- |
| 胎牛血清 | Tian hang | -- | |
| 氢化可的松 | Abcam | -- | |
| 胰岛素 | Abcam | -- | |
| 基因编辑 | PX458载体 | addgene | 48318 |
| RNA提取 | Trizol试剂 | Invitrogen | -- |
| DNase I | NEB | -- | |
| RNA质检 | Bioanalyzer 2200 | Aligent | -- |
| cDNA文库构建 | VAHTSTM Total RNA-seq 试剂盒 | -- | -- |
| RT-qPCR | SYBR Premix Ex Taq | TaKaRa | RR420L |
| Western blot | RIPA裂解液 | BOSTER | AR0105 |
| BCA蛋白定量试剂盒 | KeyGEN BioTECH | KGP902 | |
| ACADSB抗体 | sigma Antibodies | AV-54586 | |
| 微管蛋白抗体 | bioss | bs-4511R | |
| 蛋白检测 | Tanon 5200凝胶成像系统 | Tanon | -- |
| RNA提取 | RNeasy Mini试剂盒 | Qiagen | 74134 |
| cDNA合成 | RT2第一链cDNA合成试剂盒 | Qiagen | 330404 |
| RT2 PCR Array | RT2 Profiler PCR芯片 | Qiagen | CLAB24070A |
| qPCR | Mx3005p实时荧光定量PCR仪 | Agilent Stratagene | -- |
| 脂质含量测定 | 甘油三酯检测试剂盒 | -- | -- |
| 组织/细胞总胆固醇检测试剂盒 | Applygen Technologies | -- | |
| 游离脂肪酸检测试剂盒 | Solarbio life sciences | -- | |
| 酶标仪 | YongChuang SM600 | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | 培养基成分（DMEM/F12、10% FBS、氢化可的松、胰岛素），细胞来源 阅读提示：Materials and Methods - Preparation of Cells and Cell Culture |
| 基因敲除 | sgRNA靶序列（外显子5）、载体PX458、转染方法、流式分选条件、单细胞培养条件 阅读提示：Materials and Methods - Constructing Knockout Vector, Results - Generation of ACADSB–/– bMECs |
| RNA-seq | RNA提取方法、建库试剂盒、测序平台、比对参数、DEG筛选标准（EBSeq） 阅读提示：Materials and Methods - Sample Collection, RNA Sequencing Mapping, DEG Analysis |
| 脂质含量测定 | 细胞接种密度（2×10^5/孔）、试剂盒类型、检测方法、蛋白校正 阅读提示：Materials and Methods - Analysis of Triglyceride, Cholesterol and Free Fatty Acids Contents |
| RT2 PCR阵列 | RNA量（1μg）、试剂盒、看家基因选择、数据分析方法 阅读提示：Materials and Methods - Validation of mRNAs by RT2 Profiler PCR Array |