软脑膜组织的显微解剖与消化
获取纯化的软脑膜细胞用于后续实验。
从小鼠颅骨中显微解剖出软脑膜组织，并用胶原酶和dispase消化成单细胞悬液。
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软脑膜成纤维细胞的特征描述、分离及体外培养
Characterization, isolation, and in vitro culture of leptomeningeal fibroblasts.
实验完整度
中研究包含体外细胞培养、流式细胞术、转录组测序、组织学染色及公共数据库分析等，但主要聚焦于标志物鉴定与培养方法建立，缺乏功能获得/缺失等机制验证（如敲低或过表达）。
主要模型
小鼠原代软脑膜成纤维细胞 小鼠原代硬脑膜成纤维细胞 人软脑膜、硬脑膜、肺及乳腺成纤维细胞
重点核对
分离软脑膜时使用CD31/CD45双重阴性细胞进行RNA测序，以鉴定候选标志物 ICAM1和SLC38A2在体外培养的成纤维细胞中的表达通过免疫荧光和定量PCR验证 ICAM1和SLC38A2在人及小鼠脑膜组织中的表达通过免疫组化验证 使用公共scRNA-seq和原位杂交数据验证Icam1和Slc38a2在软脑膜细胞中的表达
摘要
脑膜，即大脑和脊髓的膜性覆盖物，是众多疾病病理过程的宿主。在本研究中，我们提供了一种分离软脑膜细胞层、在组织学切片中识别软脑膜以及在体外培养中维持软脑膜成纤维细胞的方法。通过一系列转录组学、组织学和细胞计数分析，我们确定了ICAM1和SLC38A2是体内和体外软脑膜细胞的两个新标志物。我们的结果证实了软脑膜细胞的成纤维细胞特性及其形成覆盖脑和脊髓实质的片状层的能力。这些发现将使中枢神经系统屏障领域的研究人员能够描述软脑膜细胞在健康和疾病中的功能。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 如何可靠地分离和培养成年小鼠软脑膜成纤维细胞，并鉴定其特异性标志物？
- 核心机制
- ICAM1和SLC38A2被鉴定为成年小鼠和人类软脑膜成纤维细胞的标志物，它们在体内和体外稳定表达。
- 主要证据
- 通过免疫荧光、免疫组化、流式细胞术和定量PCR验证了ICAM1和SLC38A2在软脑膜成纤维细胞中的表达，并利用公共scRNA-seq和原位杂交数据进一步确认。
- 研究意义
- 这些标志物可用于识别和分离软脑膜细胞，进一步研究其在中枢神经系统屏障中的功能及病理作用。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
成纤维细胞的体外培养
验证软脑膜细胞能否在体外培养并保持成纤维细胞特性。
将软脑膜单细胞悬液接种于培养板，利用差速贴壁法富集成纤维细胞，并培养10-14天。
流式细胞术分析与分选
鉴定软脑膜细胞表面标志物并分选特定细胞群进行分析。
使用流式细胞术分析软脑膜单细胞悬液中CD45/CD31阴性细胞的比例，并分选这些细胞进行RNA测序。
候选标志物的筛选
通过转录组学数据筛选软脑膜细胞特异性标志物。
对分选的CD45/CD31阴性细胞进行bulk RNA测序，利用数据库和表达丰度分析筛选候选基因。
标志物验证
验证候选标志物在软脑膜成纤维细胞中的表达。
通过免疫荧光、免疫组化和定量PCR检测ICAM1和SLC38A2在培养的成纤维细胞和脑膜组织中的表达。
单细胞RNA-seq和原位杂交验证
验证ICAM1和SLC38A2在软脑膜细胞中的表达。
分析Allen Brain Map的VLMC单细胞转录组数据，并检查公共原位杂交数据。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 组织消化 | 胶原酶 | Worthington | LS005273 |
| 分散酶 | StemCell Technologies | 07913 | |
| 脱氧核糖核酸酶I | Worthington | LS006333 | |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | MSKCC Media Core | HG |
| 脑膜细胞培养基 | Sciencell | 1400 | |
| 流式分析 | 抗小鼠CD31抗体 | Biolegend | 102429 |
| 抗小鼠CD45抗体 | BD Biosciences | 564279 | |
| 抗小鼠CD45抗体 | Biolegend | 103108 | |
| 抗小鼠CD31抗体 | Biolegend | 102406 | |
| 抗小鼠Ter119抗体 | Biolegend | 116206 | |
| 抗小鼠CD54/Icam1抗体 | Biolegend | 116129 | |
| Live/Dead可固定死细胞染色试剂盒 | Invitrogen | L34969 | |
| Live/Dead可固定死细胞染色试剂盒 | Invitrogen | L34973 | |
| 流式分选 | Aria SORP流式细胞分选仪 | BD | -- |
| RNA提取 | RNeasy Micro试剂盒 | Qiagen | 74034 |
| RNA测序 | SMART-Seq v4超低起始量RNA试剂盒 | Clonetech | 63488 |
| KAPA Hyper Prep试剂盒 | Kapa Biosystems | KK8504 | |
| HiSeq 3000/4000 SBS试剂盒 | Illumina | -- | |
| 定量PCR | High Capacity反转录试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | 4368814 |
| TaqMan探针 | Thermo Scientific | -- | |
| TaqMan Advanced Master Mix | Applied Biosystems | 4444963 | |
| ViiA 7实时荧光定量PCR系统 | Applied Biosystems | -- | |
| 免疫荧光 | 抗人ICAM1抗体 | R&D | BBA17 |
| 抗小鼠ICAM1抗体 | R&D | AF796 | |
| 抗小鼠/人SLC38A2抗体 | Bioss | bs-12125R | |
| DAPI | Thermo Fisher | D1306 | |
| 鬼笔环肽AF647 | Thermo Fisher | A22287 | |
| Prolong Diamond抗淬灭封片剂 | Thermo Fisher | P36961 | |
| Mirax玻片扫描仪 | Zeiss | -- | |
| SP5共聚焦显微镜 | Leica | -- | |
| 组织学 | 10%中性福尔马林 | Sigma | HT4501128 |
| 1x Dako抗原修复液 | Agilent | S1699 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 软脑膜分离 | 小鼠品系、年龄，解剖时组织需保持低温，消化液成分及浓度。 阅读提示：Methods - Mice, 以及 Step-by-step protocol of mouse leptomeninges microdissection |
| 细胞培养 | 培养基成分（DMEM、FBS、青霉素-链霉素），培养时间（10-14天）和传代次数。 阅读提示：Methods - In vitro culture of cranial and extracranial fibroblasts |
| 流式分选 | 抗体组合（CD31, CD45, Ter119, Icam1），分选细胞前需要排除死细胞。 阅读提示：Methods - Flow cytometry and sorting |
| 转录组分析 | RNA提取试剂盒，建库方法，测序平台和比对软件。 阅读提示：Methods - Bulk transcriptomics and single-cell transcriptomics data analysis |
| 定量PCR | TaqMan探针，内参基因（Actb），数据处理方法（2^-ΔΔCq）。 阅读提示：Methods - Quantitative PCR |