体内动脉粥样硬化模型建立
评估TRAM缺陷对高脂饮食诱导的动脉粥样硬化发病的影响。
构建Apoe−/−Tram−/−小鼠，与Apoe−/−Tram+/+对照，给予高脂饮食8周，通过H&E、油红O、天狼星红染色分析斑块大小、脂质沉积、胶原含量，并检测血浆脂质和细胞因子水平。
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通过TRAM缺失生成的消退型单核细胞减轻动脉粥样硬化
Resolving monocytes generated through TRAM deletion attenuate atherosclerosis.
实验完整度
高包含体内动物模型（Apoe-/-Tram-/-）与体外骨髓单核细胞培养、单细胞测序、机制验证（Western blot、共聚焦、siRNA共培养）及过继转输实验。
主要模型
Apoe−/−Tram−/−小鼠 骨髓来源单核细胞（BMMs） 高脂饮食诱导的动脉粥样硬化小鼠模型
重点核对
TRAM缺失对单核细胞CCR2和SIRP-α表达的影响（体内和体外） 低剂量LPS（100 pg/mL）处理5天的条件 CD200R在单核细胞上的表达及其在共培养中的传播作用 PPARγ、PEX5蛋白表达及过氧化物酶体-溶酶体融合和ROS水平 TRAM缺陷单核细胞过继转输对动脉粥样硬化斑块大小和脂质沉积的影响
摘要
低度炎症性单核细胞的极化促进动脉粥样硬化的发病机制。然而，有助于动脉粥样硬化消退的解决单核细胞极化的潜在机制和方法尚未明确确立。在本报告中，我们证明TRIF相关接头分子（TRAM）在体内和体外介导单核细胞极化。TRAM通过激活Src家族激酶c-SRC控制单核细胞极化，c-SRC不仅诱导STAT1/STAT5调节的炎症介质CCR2和SIRP-α，还抑制PPARγ调节的消退介质CD200R。由于TRAM缺陷导致的PPARγ和Pex5增强促进了过氧化物酶体稳态和细胞活性氧的减少，进一步有助于建立消退型单核细胞表型。TRAM缺陷型单核细胞通过CD200R介导的细胞间通讯将消退表型传播给邻近单核细胞。在转化水平上，我们显示TRAM缺陷小鼠对高脂饮食诱导的动脉粥样硬化发病具有抵抗力。我们进一步证明，将TRAM缺陷的消退型单核细胞静脉输注给动脉粥样硬化小鼠可有效减缓动脉粥样硬化的进展。总之，我们的数据揭示，靶向TRAM可能有助于有效生成消退型单核细胞，有利于动脉粥样硬化的治疗。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- TRAM介导的低度炎症性单核细胞极化是否促进动脉粥样硬化，以及TRAM缺陷能否生成消退型单核细胞并减轻动脉粥样硬化？
- 核心机制
- TRAM通过激活c-SRC，进而激活STAT1/STAT5促进炎症介质CCR2和SIRP-α表达，同时抑制PPARγ和PEX5介导的过氧化物酶体自噬，导致细胞内ROS积累，促进炎症性单核细胞极化；TRAM缺陷则增强PPARγ和PEX5，促进过氧化物酶体稳态和消退型表型，并通过CD200R介导的细胞间通讯传播消退表型。
- 主要证据
- 体内实验显示Apoe-/-Tram-/-小鼠动脉粥样硬化斑块减小、脂质沉积减少、胶原增加；体外BMMs中TRAM缺陷降低CCR2和SIRP-α表达，升高CD200R；单细胞测序显示TRAM缺陷单核细胞呈现消退特征；共培养实验表明TRAM缺陷单核细胞通过CD200R传播消退表型；过继转输TRAM缺陷单核细胞减轻动脉粥样硬化。
- 研究意义
- 靶向TRAM可能有助于生成消退型单核细胞，为免疫细胞疗法治疗动脉粥样硬化提供概念基础。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
单核细胞极化表型分析
检测TRAM缺陷对体内炎症性单核细胞极化（CCR2、SIRP-α表达）的影响。
从外周血、骨髓、脾脏和主动脉分离单核细胞，通过流式细胞术检测Ly6C++和Ly6C+单核细胞表面CCR2和SIRP-α的表达。
体外单核细胞极化模型建立
研究TRAM在低剂量LPS诱导的单核细胞炎症极化中的作用。
从WT和Tram−/−小鼠骨髓细胞，在M-CSF存在下，用PBS或100 pg/mL LPS处理5天，分析CCR2、SIRP-α表达及STAT1、STAT5、SRC磷酸化。
单细胞转录组分析
全局解析TRAM缺陷对单核细胞极化的影响及消退表型的特征。
对LPS或PBS处理的WT和Tram−/−骨髓单核细胞进行单细胞RNA测序，聚类分析并比较基因表达差异。
过氧化物酶体稳态检测
验证TRAM缺陷是否恢复过氧化物酶体自噬并减少ROS。
通过Western blot检测PPARγ和PEX5蛋白水平，用共聚焦显微镜观察过氧化物酶体-溶酶体共定位，并用CellROX探针检测ROS水平。
共培养和Transwell实验
验证TRAM缺陷单核细胞是否通过CD200R介导细胞间通讯传播消退表型。
将WT或Tram−/− BMMs（CD45.2+）与B6 SJL来源的BMMs（CD45.1+）共培养或Transwell分离培养，检测受体细胞的CCR2、SIRP-α和CD200R表达，并用siRNA敲低CD200R验证。
过继转输实验
评估TRAM缺陷单核细胞输注对动脉粥样硬化进展的治疗效果。
将Apoe−/−Tram−/−或Apoe−/−Tram+/+来源的BMMs经静脉注射给已喂食HFD 4周的Apoe−/−Tram+/+小鼠，每周一次共4周，然后分析斑块和血浆指标。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI 1640培养基 | -- | -- |
| 巨噬细胞集落刺激因子 | -- | -- | |
| 脂多糖 | -- | -- | |
| 免疫染色 | 抗CD11b抗体 | BioLegend | no. 101226 |
| 抗Ly6C抗体 | BioLegend | no. 128018 | |
| 抗CCR2抗体 | BioLegend | no. 150628 | |
| 抗SIRP-α抗体 | BioLegend | no. 144014 | |
| 抗CD200R抗体 | BioLegend | no. 123916 | |
| 抗CD16/CD32抗体 | BD Biosciences | no. 553141 | |
| 流式细胞术 | 碘化丙啶 | MilliporeSigma | -- |
| FACSCanto II流式细胞仪 | BD Biosciences | -- | |
| Western blot | RIPA裂解缓冲液 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | MilliporeSigma | -- | |
| 抗PPARγ抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-7273 | |
| 抗PEX5抗体 | Proteintech | 12545-1-AP | |
| 抗磷酸化STAT1抗体 | Cell Signaling Technology | 9177 | |
| 抗磷酸化STAT5抗体 | Cell Signaling Technology | 9359 | |
| 抗磷酸化SRC抗体 | Cell Signaling Technology | 2105 | |
| β-肌动蛋白抗体 | Cell Signaling Technology | 5125 | |
| 组织消化 | I型胶原酶 | Worthington | -- |
| XI型胶原酶 | MilliporeSigma | -- | |
| 透明质酸酶 | MilliporeSigma | -- | |
| 脱氧核糖核酸酶 | MilliporeSigma | -- | |
| 单细胞测序 | 10x Genomics Chromium单细胞3'试剂盒 | 10x Genomics | -- |
| Illumina HiSeq 4000测序平台 | Illumina | -- | |
| 共聚焦显微镜 | LSM 900共聚焦显微镜 | ZEISS | -- |
| siRNA转染 | 脂质体转染试剂 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 细胞分选 | SH800细胞分选仪 | Sony | -- |
| 细胞培养 | RPMI 1640培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| L-谷氨酰胺 | -- | -- | |
| 青霉素/链霉素 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物饲养与基因型 | 小鼠背景（C57BL/6），年龄（8-10周），性别（雄雌兼用无性别差异），SPF条件。 阅读提示：Methods - Mice |
| 高脂饮食模型 | 高脂饲料类型和喂食时长（8周），动脉粥样硬化评估（斑块大小、脂质沉积、胶原含量）。 阅读提示：Methods - HFD feeding and adoptive transfer; Figure 1 legend |
| 体外单核细胞极化 | 骨髓分离方法，M-CSF浓度（10 ng/mL），LPS剂量（100 pg/mL），处理时长（5天），LPS更换频率（每2天）。 阅读提示：Methods - Flow cytometry analyses of in vitro-primed BMMs |
| 单细胞测序 | 细胞制备条件（PBS/LPS处理），建库试剂盒（10x Genomics），测序平台（Illumina HiSeq），参考基因组版本。 阅读提示：Methods - Single-cell sequencing and analysis |
| 共培养实验 | 供体细胞（WT或Tram−/−，CD45.2+）和受体细胞（B6 SJL，CD45.1+）预处理和共培养条件，siRNA敲低CD200R效率。 阅读提示：Methods - CD200R knockdown and coculture assay |
| 过继转输 | 受体小鼠（Apoe−/−），饮食诱导时间（4周），转输细胞量（3×10^6），次数和频率（每周1次，共4周），转输后分析时间（末次转输后1周）。 阅读提示：Methods - HFD feeding, adoptive transfer, and sample collection; Figure 7 legend |