高通量筛选
鉴定能增强奥希替尼诱导的生长抑制的化合物。
使用约1000种化合物的定制文库，在H1975和HCC827细胞中进行，检测化合物±奥希替尼处理后的细胞活力。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
靶向Aurora B激酶通过增强BIM和PUMA介导的凋亡来预防和克服肺癌中EGFR抑制剂的耐药性
Targeting Aurora B kinase prevents and overcomes resistance to EGFR inhibitors in lung cancer by enhancing BIM- and PUMA-mediated apoptosis.
实验完整度
高包含体外细胞实验、基因敲除/敲除、异种移植模型及患者来源异种移植模型，并进行机制研究（如激酶实验、免疫沉淀）和功能验证。
主要模型
H1975细胞系（EGFR L858R/T790M） ECLC26患者来源细胞系（EGFR L858R） H1975异种移植模型 患者来源异种移植模型（ECLC26、Ru813c、Lx1114）
重点核对
Aurora B激酶抑制剂（如PF03814735）浓度及处理时间 奥希替尼浓度及处理时间 BIM和PUMA表达水平 EMT状态（E-cadherin、vimentin表达） ATR-CHK1-AURKB通路激活状态
摘要
EGFR抑制剂在EGFR突变肺癌中的临床成功受到最终出现的获得性耐药的限制。我们假设通过联合治疗增强凋亡可以根除癌细胞并减少耐药持久性细胞的产生。通过对约1000种化合物的定制文库进行高通量筛选，我们发现Aurora B激酶抑制剂是奥希替尼诱导凋亡的强效增强剂。机制上，Aurora B抑制通过减少Ser87磷酸化来稳定BIM，并通过FOXO1/3反式激活PUMA。重要的是，由上皮间质转化（EMT）引起的奥希替尼耐药激活了ATR-CHK1-Aurora B信号级联，从而通过激活BIM介导的有丝分裂灾难对这些激酶抑制剂产生超敏反应。EGFR和Aurora B的联合抑制不仅能有效消除癌细胞，还能克服EMT以外的耐药。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 如何通过增强凋亡来预防和克服EGFR抑制剂在EGFR突变肺癌中的获得性耐药。
- 核心机制
- Aurora B抑制通过降低BIM S87磷酸化稳定BIM，并通过FOXO1/3转录激活PUMA，增强奥希替尼诱导的凋亡；EMT驱动的耐药激活ATR-CHK1-AURKB通路，使细胞对Aurora B抑制剂敏感，通过BIM介导的有丝分裂灾难导致细胞死亡。
- 主要证据
- 基于HTS筛选、体外凋亡实验、基因敲除/敲除、免疫印迹、异种移植模型等，证明AURKB抑制与EGFR抑制协同诱导凋亡，且EMT细胞对AURKB抑制敏感。
- 研究意义
- 提示EGFR和AURKB联合抑制可能是治疗EGFR突变肺癌的有效策略，包括克服EMT介导的耐药。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证凋亡增强
验证候选化合物是否能增强奥希替尼诱导的凋亡。
在多个EGFR突变NSCLC细胞系中，用膜联蛋白V染色检测细胞死亡。
机制研究
阐明Aurora B抑制如何增强凋亡。
通过免疫印迹、qRT-PCR、基因敲除等研究BIM和PUMA的调控。
耐药模型建立
建立奥希替尼耐药细胞系并表征其特性。
通过逐步增加奥希替尼浓度建立耐药细胞系，并分析其EMT标志物和信号通路。
体内验证
评估奥希替尼和PF联合治疗的体内疗效。
在异种移植模型（包括PDX）中，用载体、奥希替尼、PF或联合治疗，监测肿瘤生长。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
评估体内效果
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 高通量筛选 | 高通量筛选化学文库 | Selleck Chemicals | -- |
| 药物处理 | 奥希替尼 | Selleck Chemicals | S7297 |
| PF03814735 | Selleck Chemicals | S2725 | |
| 帕博西尼 | Selleck Chemicals | S1116 | |
| 诺考达唑 | Selleck Chemicals | S2775 | |
| 细胞培养 | 基质胶 | BD Biosciences | -- |
| 免疫印迹 | BIM抗体 | EMD Biosciences | 202000 |
| 磷酸化BIM(Ser87)抗体 | Bioss Inc | bs-3012R | |
| 流式细胞术 | 膜联蛋白V-FITC | BioVision | 1001-1000 |
| 细胞活力检测 | alamarBlue活力检测 | Thermo Fisher Scientific | DAL1100 |
| CellTiter-Glo发光细胞活力检测 | Promega | G7572 | |
| RNA-seq | TRIzol试剂 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| RNeasy Mini试剂盒 | Qiagen | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | 细胞系来源和培养基，如H1975、HCC827、PC9、ECLC26的培养条件 阅读提示：STAR Methods的Cell Line Authentication部分 |
| 药物处理 | 奥希替尼和PF03814735的浓度、处理时间 阅读提示：图例和图2A、图4A、图5C等 |
| 凋亡检测 | 膜联蛋白V染色的细胞处理时间和浓度 阅读提示：STAR Methods的Cell Viability Assays部分 |
| 机制研究 | 用于siRNA转染的浓度和试剂 阅读提示：STAR Methods的Plasmid Construction等部分 |
| 体内实验 | 动物品系、细胞注射数量、给药剂量和频率 阅读提示：STAR Methods的Animal Models部分 |