脱细胞冻干羊膜移植通过调控结缔组织生长因子和基质金属蛋白酶-2抑制子宫内膜纤维化

Transplantation of decellularized and lyophilized amniotic membrane inhibits endometrial fibrosis by regulating connective tissue growth factor and tissue inhibitor of matrix metalloproteinase-2.

作者信息Xing Chen, Yan Zhou, Ying Sun, Tonghui Ji, Huihua Dai
PMID34335910
发布时间2021-09
DOI10.3892/etm.2021.10400

实验完整度

采用大鼠IUA模型,包含组织学(Van Gieson染色)和免疫组化(CTGF、MMP-2)验证,但缺乏功能验证或机制验证的独立证据层级。

主要模型

Sprague Dawley大鼠宫腔粘连模型(子宫内膜刮除) 脱细胞冻干人羊膜(DL-AM)

重点核对

大鼠品系:Sprague Dawley,雌性,8周龄,体重180-220g 模型建立:左侧子宫刮除至基质层(至少1/3),右侧子宫作为对照 DL-AM移植:移植至刮除的子宫内表面,缝合 观察时间点:术后3、7、14、28天 统计方法:one-way ANOVA和Tukey事后检验

摘要

宫腔粘连(IUA)是一种以子宫内膜损伤引起的子宫内膜纤维化为特征的疾病。在本研究中,将脱细胞冻干人羊膜(DL-AM)材料移植到大鼠模型中,以探讨其对IUA的预防作用。将24只Sprague Dawley大鼠随机分为IUA组(n=12)和IUA+DL-AM组(n=12)。为建立模型,刮除左侧子宫的内膜,右侧子宫作为对照。IUA组刮除后直接缝合,不进行其他处理;IUA+DL-AM组则将DL-AM移植到刮除的子宫上。术后3、7、14和28天切除子宫进行组织学和免疫组织化学评估。结果证实了IUA的发展,伴随纤维化面积率的增加。IUA组结缔组织生长因子(CTGF)的积分光密度(IOD)值较对照组升高,而基质金属蛋白酶-2(MMP-2)降低(P<0.05)。DL-AM移植后,与IUA组相比,CTGF的IOD值下降,而MMP-2升高(P<0.05)。然而,与对照组相比,IUA+DL-AM组CTGF的IOD值仍较高,而MMP-2仍较低(P<0.05)。此外,在IUA组和IUA+DL-AM组中均未检测到子宫内膜再生的证据。总体而言,这些结果表明,在IUA大鼠模型中,移植DL-AM在一定程度上具有预防纤维化形成的潜力,因此可能是治疗该病的一种替代策略。

实验结论

提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。

研究问题
DL-AM移植是否能预防宫腔粘连大鼠模型的子宫内膜纤维化,及其机制是否涉及CTGF和MMP-2的调控?
核心机制
DL-AM通过下调CTGF和上调MMP-2表达,部分抑制子宫内膜纤维化。
主要证据
在大鼠IUA模型中,与IUA组相比,DL-AM移植后纤维化面积率降低,CTGF IOD值下降,MMP-2 IOD值升高(均有统计学意义)。
研究意义
DL-AM可能作为管理宫腔粘连的替代策略。

研究路径

按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

1

制备DL-AM

验证脱细胞和冻干处理是否成功去除羊膜上皮细胞。

将羊膜与绒毛膜分离,用0.2% EDTA脱细胞,冻干,裁剪成约2.5x2.5 cm,经Co60 γ射线灭菌。通过大体观察、光镜、扫描电镜和H&E染色确认无上皮细胞。

2

建立IUA大鼠模型并移植DL-AM

模拟子宫内膜损伤,评估DL-AM移植对IUA的预防作用。

24只SD大鼠随机分为IUA组和IUA+DL-AM组,每组12只。左侧子宫刮除内膜至基质层,IUA组直接缝合,IUA+DL-AM组移植DL-AM后缝合。术后不同时间点取材。

3

组织学评估纤维化程度

比较各组纤维化面积百分比。

子宫组织固定、包埋、切片,行Van Gieson染色,计算纤维化面积占子宫内膜面积的比例。

4

免疫组化检测CTGF和MMP-2表达

评估DL-AM移植对CTGF和MMP-2蛋白表达的影响。

使用抗CTGF和抗MMP-2抗体进行免疫组化染色,计算IOD值。

研究方法

按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。

评估体内效果
验证分子表达变化

产品清单

实验环节名称品牌货号
Van Gieson染色试剂盒Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.--
抗CTGF抗体Biossbs-0843R
抗MMP-2抗体Biossbs-4599R
二抗OriGene Technologies, Inc.TA130001
扫描电子显微镜Hitachi, Ltd.S-3400N
ImagePro Plus v6.0Media Cybernetics, Inc.--

关键环节

汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

环节核对要点
DL-AM制备
脱细胞处理:0.2% EDTA孵育30分钟;灭菌:Co60 γ射线照射25 kGy
阅读提示:Materials and methods,Preparation of DL-AM
动物模型建立
大鼠品系、性别、年龄、体重;刮除深度(至少1/3基质层);麻醉剂量(戊巴比妥40 mg/kg)
阅读提示:Materials and methods,Establishment of an IUA rat model and DL-AM transplantation
组织学评估
切片厚度(5 µm);染色方法(Van Gieson);纤维化面积率定义
阅读提示:Materials and methods,Histology and immunohistochemistry
免疫组化评估
一抗稀释比(1:200);二抗稀释比(1:100);抗原修复条件(柠檬酸钠,95-100°C,10分钟)
阅读提示:Materials and methods,Histology and immunohistochemistry
统计分析
统计方法(one-way ANOVA和Tukey事后检验);软件(SPSS 24.0)
阅读提示:Materials and methods,Statistical analysis