细胞系建立
从耐药乳腺癌患者胸腔积液中分离并建立新的乳腺癌细胞系。
收集胸腔积液，离心、洗涤，用含10% FBS的DMEM培养，收集贴壁细胞并传代。
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来自耐药乳腺癌患者胸腔积液的HER2阳性细胞系的建立与特征鉴定
Establishment and Characterization of a HER2-Positive Cell Line Derived From the Pleural Effusion of a Drug-Resistant Breast Cancer Patient.
实验完整度
高包含体外细胞系建立与鉴定、功能实验（增殖、侵袭、集落形成）、体内裸鼠成瘤实验及药物敏感性验证等多个独立证据层级。
主要模型
4Z-B-1细胞系（来自耐药乳腺癌患者胸腔积液） SK-BR-3细胞系（对照） 裸鼠异种移植模型
重点核对
细胞系来源：胸腔积液，耐药乳腺癌患者 分子亚型：HER2阳性，ERα和PR阴性 药物敏感性：对trastuzumab、lapatinib、pyrotinib敏感，对pertuzumab耐药 体内成瘤：4×10^6细胞皮下注射裸鼠，21天 对照细胞系：SK-BR-3、MCF-7、MDA-MB-231等
摘要
耐药是乳腺癌治疗中的一项严峻挑战，使其成为研究中亟待解决的问题。细胞系是基础研究和临床前研究的重要工具；然而，目前可用的来自耐药患者的乳腺细胞系很少。在此，我们建立了一个新的HER2阳性乳腺癌细胞系，来源于一位耐药转移性乳腺癌患者的胸腔积液。该细胞系在裸鼠中具有强大的增殖能力和致瘤性，但侵袭和集落形成能力较弱。该细胞系的分子亚型及其对化疗药物和HER2靶向药物的敏感性与原发灶不同，提示乳腺癌原发与转移形式之间存在表型变化。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 能否从耐药乳腺癌患者的胸腔积液中建立新的HER2阳性乳腺癌细胞系，并对其生物学特性和药物敏感性进行表征？
- 核心机制
- 原发肿瘤向转移灶演变过程中发生分子亚型转换（ERα/PR由阳性转为阴性），可能与肿瘤进化或雌激素非依赖性获得有关。
- 主要证据
- 通过Western blot、流式细胞术、transwell侵袭实验、3D球体侵袭实验、裸鼠移植瘤实验及免疫组化等，证实4Z-B-1细胞系具有增殖能力强、侵袭力弱、致瘤性高的特点，且对部分HER2靶向药物敏感。
- 研究意义
- 该细胞系可作为研究转移性HER2阳性乳腺癌的新型体外和体内模型。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
细胞形态与超微结构观察
观察细胞形态特征及表面结构。
使用扫描电子显微镜和透射电子显微镜观察2D培养细胞和3D球体的表面及内部结构。
细胞纯度与支原体检测
验证细胞纯度及无支原体污染。
通过流式细胞术检测pan-CK表达，PCR法检测支原体。
分子表型和核型分析
确定细胞系的分子亚型和染色体特征。
Western blot检测ERα、PR、HER2表达；染色体核型分析。
增殖能力评估
评估细胞系的增殖速率和细胞周期分布。
CCK-8法绘制生长曲线，流式细胞术分析细胞周期，Western blot检测CyclinE1。
迁移和侵袭能力评估
评估细胞系的迁移和侵袭能力。
Transwell实验和3D球体BME侵袭实验检测细胞迁移和侵袭。
药物敏感性测试
评估细胞系对HER2靶向药物和其他抗癌药物的敏感性。
CCK-8法检测细胞活力，计算IC50。
体内致瘤性实验
评估细胞系在体内的致瘤能力。
将细胞皮下注射入裸鼠，观察肿瘤形成和生长。
STR分析
验证细胞系的独特性和人类来源。
使用PowerPlex 18D Kit进行STR分析，并与数据库比对。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证分子表达变化
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | McCoy's 5a改良培养基 | -- | -- |
| Eagle最低必需培养基 | -- | -- | |
| RPMI-1640培养基 | -- | -- | |
| Leibovitz's L-15培养基 | -- | -- | |
| Hybri-Care培养基 | -- | -- | |
| DMEM培养基 | -- | -- | |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 胰岛素 | -- | -- | |
| 细胞分离 | 胰蛋白酶-EDTA | Invitrogen | -- |
| 细胞培养 | 青霉素 | -- | -- |
| 链霉素 | -- | -- | |
| 电子显微镜样品制备 | 蔗糖 | Sigma | -- |
| 电子显微镜 | ACE200镀膜系统 | Leica | -- |
| Nova Nano 450显微镜 | Thermo FEI | -- | |
| Tecnai G2 spirit显微镜 | Thermo FEI | -- | |
| 流式细胞术 | 抗细胞角蛋白（泛）异硫氰酸荧光素抗体 | Cell Signaling Technology | 4545 |
| PE小鼠抗人CD24 | BD Biosciences | 555428 | |
| FITC小鼠抗人CD44 | BD Biosciences | 555478 | |
| FACScan流式细胞仪 | BD Bioscience | -- | |
| 细胞周期分析 | 细胞周期分析试剂盒 | Dojindo | -- |
| 细胞活力检测 | CCK8试剂盒 | APExBio | -- |
| 细胞遗传学分析 | 秋水仙胺 | -- | -- |
| Remel Giemsa Plus染色试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 支原体检测 | 支原体检测试剂盒 | Beyotime | -- |
| 蛋白质印迹 | PVDF膜 | Merck Millipore | -- |
| 脱脂奶粉 | BD Biosciences | -- | |
| ERα一抗 | CST | 8644 | |
| PR一抗 | CST | 8757 | |
| HER2一抗 | Abcam | AB16899 | |
| CDK6一抗 | EPITOMICS | 3524-1 | |
| CyclinE1一抗 | EPITOMICS | 1655-1 | |
| ZO1一抗 | CST | 8193 | |
| E-钙粘蛋白一抗 | CST | 3195 | |
| ZEB1一抗 | CST | 3396 | |
| N-钙粘蛋白一抗 | CST | 13116 | |
| 波形蛋白一抗 | CST | 5741 | |
| Snail一抗 | CST | 3879 | |
| Slug一抗 | CST | 9585 | |
| Claudin-1一抗 | CST | 13255 | |
| β-连环蛋白一抗 | CST | 8480 | |
| EGFR一抗 | CST | 4267 | |
| p-EGFR (Y1068)一抗 | CST | 3777 | |
| Caveolin一抗 | CST | 3267 | |
| STAT3一抗 | BIOSS | bs-1141R | |
| p-PTEN (S380)一抗 | CST | 9551 | |
| Akt一抗 | CST | 4691 | |
| p-Akt (T306)一抗 | CST | 13038 | |
| Bcl-X一抗 | EPITOMICS | 1018-1 | |
| Bcl-2一抗 | Hua Bio | 0407-7 | |
| β-肌动蛋白一抗 | Santa Cruz | sc-477748 | |
| HRP标记二抗 | CST | -- | |
| Pico ECL试剂盒 | FDbio | -- | |
| Amersham Imager 600成像仪 | GE Healthcare | -- | |
| 侵袭实验 | 基质胶 | BD Biosciences | -- |
| 结晶紫 | Solarbio | -- | |
| 倒置显微镜 | ZEISS | -- | |
| 3D侵袭实验 | 3D球体BME细胞侵袭实验试剂盒 | Trevigen | 3500-096-K |
| 动物实验 | 基质胶 | Corning | -- |
| 免疫组织化学 | GT vision III免疫组化检测试剂盒 | Gene Tech | GK500710 |
| STR分析 | PowerPlex 18D试剂盒 | Promega | -- |
| ABI Prism 3500xl基因分析仪 | Applied Biosystems | -- | |
| 统计分析 | Prism软件 | GraphPad Inc. | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞系建立 | 胸腔积液样本来源、离心条件、培养基组成 阅读提示：Methods: Cell Isolation and Cell Line Establishment |
| 细胞培养 | 培养基类型、血清浓度、CO2浓度、温度 阅读提示：Methods: Cell Lines and Reagents |
| 细胞纯度与支原体检测 | 细胞代数、pan-CK表达率、支原体检测方法 阅读提示：Results: Purity and Mycoplasma Contamination |
| 分子表型鉴定 | 细胞代数、对照细胞系、抗体信息 阅读提示：Results: Molecular Phenotype and Chromosome Analysis; Methods: Western Blotting |
| 增殖实验 | 细胞代数、接种密度、检测时间点、CCK8试剂盒 阅读提示：Methods: Cell Counting Kit (CCK)-8 Cell Growth Assay; Results: Proliferative, Migratory, and Invasive Potential |
| 迁移和侵袭实验 | 细胞代数、细胞数、基质胶、孵育时间 阅读提示：Methods: In vitro Invasion Assay; Results: Proliferative, Migratory, and Invasive Potential |
| 药物敏感性测试 | 细胞代数、药物浓度梯度、处理时间、检测方法 阅读提示：Methods: Evaluating Sensitivity to Anticancer Agents; Results: Sensitivity to HER2 Targeting Agents and Other Anticancer Agents |
| 体内致瘤性实验 | 细胞代数、细胞数、Matrigel比例、小鼠品系、周龄、观察时间 阅读提示：Methods: Tumorigenicity in Nude Mice; Results: Putative Stemness and Tumorigenicity in vitro and in vivo |
| STR分析 | 细胞代数、STR试剂盒、分析仪器 阅读提示：Methods: Verification of Cell Lines by ATCC; Results: DNA Fingerprinting/STR Analysis |