全转录组测序及差异表达分析
鉴定高、低腹脂率鸡肝脏中差异表达的lncRNA、miRNA和mRNA，筛选参与脂质代谢的候选基因。
收集6只高腹脂率和6只低腹脂率三黄鸡的肝脏组织，提取总RNA，构建cDNA文库，进行lncRNA和小RNA测序，分析差异表达并鉴定新转录本。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
全转录组分析揭示LncRNA-FNIP2/miR-24-3p/FNIP2轴在鸡脂肪生成中的潜在调控机制
Whole Transcriptome Analysis Reveals a Potential Regulatory Mechanism of LncRNA-FNIP2/miR-24-3p/FNIP2 Axis in Chicken Adipogenesis.
实验完整度
高包含转录组测序、qRT-PCR、双荧光素酶报告基因、油红O染色、Western blot，以及过表达/敲低和回复实验，涵盖多层级功能与机制验证。
主要模型
六只高腹脂率三黄鸡与六只低腹脂率三黄鸡的肝脏组织 永生化鸡前脂肪细胞ICP1
重点核对
高/低腹脂率分组依据腹脂率：低组2.81-3.89%，高组8.04-9.75% ICP1细胞培养条件：DMEM/F12培养基，10%胎牛血清，0.1%/0.2%青霉素/链霉素，5% CO2，37°C 转染剂量：DNA为1 μg/well（12孔板）或0.1 μg/well（96孔板）；寡核苷酸终浓度50 μM 成脂诱导：转染后12小时，使用含15%胎牛血清和0.2%油酸的培养基诱导48小时
摘要
脂质生物合成是一个复杂的过程，受包括lncRNA在内的多种因素调控。然而，lncRNA在鸡腹部脂肪积累中的作用仍不清楚。在本研究中，我们收集了6只高腹脂率三黄鸡和6只低腹脂率三黄鸡的肝脏组织，进行lncRNA测序和小RNA测序。共有2,265个lncRNA、245个miRNA和5,315个mRNA差异表达。其中，1,136个差异表达基因富集在代谢过程中。共有36个差异表达基因被认为是差异表达lncRNA的靶标，富集在代谢过程中。此外，我们还发现8个差异表达miRNA可以靶向19个差异表达基因。FNIP2和PEX5L共享于顺式调控网络和差异表达miRNA靶向关系网络中。LncRNA-FNIP2/miR-24-3p/FNIP2轴被认为是可能参与脂质合成的潜在候选。实验上，阐明了lncRNA-FNIP2/miR-24-3p/FNIP2轴的客观真实性，并验证了lncRNA-FNIP2/miR-24-3p/FNIP2轴对合成的调控作用。简而言之，我们的研究揭示了一种潜在的新型调控机制，即lncRNA-FNIP2/miR-24-3p/FNIP2轴被认为参与鸡肝脏脂肪生成过程中的脂质合成。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- lncRNA在鸡肝脏脂肪生成过程中的调控机制尚不清楚，本研究旨在通过全转录组分析揭示潜在调控网络。
- 核心机制
- lncRNA-FNIP2作为miR-24-3p的海绵，通过竞争性内源RNA机制释放FNIP2，从而促进脂质合成。
- 主要证据
- 转录组测序和功能实验验证：FNIP2促进脂滴形成，miR-24-3p靶向抑制FNIP2，lncRNA-FNIP2通过吸附miR-24-3p恢复FNIP2表达，且突变miR-24-3p结合位点后失去该功能。
- 研究意义
- 揭示了lncRNA-FNIP2/miR-24-3p/FNIP2轴作为鸡脂肪生成的新调控机制，为理解鸡腹部脂肪沉积的表观遗传调控提供了新见解。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
lncRNA靶基因预测及网络构建
预测差异表达lncRNA的潜在靶基因，构建顺式调控网络，识别核心调控轴。
通过基因组位置和相关性分析预测lncRNA的顺式靶基因，并构建DEL-DEG相互作用网络。
miRNA靶基因预测及网络构建
预测差异表达miRNA的靶基因，构建DES-DEM网络，寻找与lncRNA网络共享的基因。
使用miRanda和RNAhybrid预测miRNA靶基因，并与差异表达mRNA交集，构建靶向关系网络。
验证FNIP2对前脂肪细胞脂质合成的影响
验证FNIP2在鸡前脂肪细胞脂质合成中的作用。
在ICP1细胞中过表达或敲低FNIP2，检测脂滴形成和脂质合成相关基因表达。
验证miR-24-3p对FNIP2的靶向调控
验证miR-24-3p是否通过靶向FNIP2抑制脂质合成。
通过双荧光素酶报告基因验证miR-24-3p与FNIP2 3'UTR的结合，并用miR-24-3p mimic/inhibitor处理ICP1细胞，检测FNIP2表达和脂滴形成。
验证lncRNA-FNIP2通过ceRNA机制调控FNIP2
验证lncRNA-FNIP2是否作为miR-24-3p海绵，解除miR-24-3p对FNIP2的抑制。
通过双荧光素酶报告基因验证lncRNA-FNIP2与miR-24-3p结合，并进行回复实验，检测FNIP2表达和脂质合成相关基因。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
差异表达分析
靶基因预测和网络构建
功能富集分析
靶向关系验证
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| RNA提取 | Trizol试剂 | Invitrogen | -- |
| RNA质量检测 | NanoDrop 2100 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 文库构建 | Ribo-ZeroTM rRNA去除试剂盒 | Epicentre | -- |
| TruSeq链特异性试剂盒 | Illumina | -- | |
| cDNA合成 | DNase I | Thermo Fisher Scientific | -- |
| RNase H | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 逆转录反应 | HiScript II Q RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper) | Vazyme | -- |
| miRNA逆转录 | miRNA第一链cDNA合成试剂盒（茎环法） | Vazyme | -- |
| qRT-PCR | ChamQ通用SYBR qPCR预混液 | Vazyme | -- |
| QuantStudio 5 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 细胞培养 | DMEM/F12培养基 | Gibco | -- |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 青霉素/链霉素 | Gibco | -- | |
| 细胞转染 | Lipofectamine 3000试剂 | Invitrogen | -- |
| 双荧光素酶报告基因 | 双荧光素酶报告基因检测试剂盒 | Vazyme | -- |
| 双荧光素酶报告基因检测 | 多功能酶标仪 | Biotek | -- |
| 成脂诱导 | 油酸 | Sigma | -- |
| 油红O染色 | 油红O染色试剂盒 | Solarbio | -- |
| 电镜？ | Nikon | -- | |
| Western blot | RIPA裂解液 | Beyotime | -- |
| PVDF膜 | Bio-Rad | -- | |
| 抗PPARγ抗体 | BIOSS | bs-0530R | |
| 抗FNIP2抗体 | BIOSS | bs-13194R | |
| 抗GAPDH抗体 | BIOSS | bsm-33033M | |
| 抗小鼠二抗 | CST | 7076P2 | |
| 抗兔二抗 | CST | 7074P2 | |
| ECL过氧化物酶显色试剂盒 | Vazyme | -- | |
| Odyssey成像系统 | Li-cor | -- | |
| 载体构建 | pmiR-GLO载体 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物分组 | 分组依据：腹脂率范围低组2.81-3.89%，高组8.04-9.75%；样本量：每组6只。 阅读提示：Methods - Samples for RNA Sequencing |
| 细胞培养与诱导 | ICP1细胞培养条件：DMEM/F12培养基，10%胎牛血清，0.1%/0.2%青霉素/链霉素，5% CO2，37°C；成脂诱导：转染后12小时，含15%胎牛血清和0.2%油酸的培养基，诱导48小时。 阅读提示：Methods - Cell Culture and Cell Transfection、Oil Red O Staining |
| 转染条件 | DNA转染剂量：1 μg/well（12孔板）或0.1 μg/well（96孔板）；寡核苷酸（mimic/inhibitor）终浓度50 μM。 阅读提示：Methods - Cell Culture and Cell Transfection |
| 双荧光素酶报告基因 | 使用pmiR-GLO载体，共转染组合：WT+miR-24-3p mimic，MT+miR-24-3p mimic，WT+mimic NC，MT+mimic NC。 阅读提示：Methods - Dual-Luciferase Reporter Assay |
| qRT-PCR内参 | U6用于miRNA，GAPDH用于mRNA和lncRNA。 阅读提示：Methods - Reverse Transcription Reaction and Quantified Real Time PCR (qRT-PCR) |