细胞极化和模型验证
建立并验证THP-1和RAW264.7细胞系M0、M1和M2巨噬细胞模型。
THP-1经PMA分化，用IFN-γ/LPS或IL-4/IL-13极化；RAW264.7用IFN-γ/LPS或IL-4极化。通过免疫荧光检测iNOS、MHC II、CD163、CD206，并验证已知标记蛋白。
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极化人THP-1和小鼠RAW264.7巨噬细胞的比较蛋白质组学分析
Comparative Proteomic Analysis of Polarized Human THP-1 and Mouse RAW264.7 Macrophages.
实验完整度
高包含体外细胞模型（THP-1和RAW264.7）极化、蛋白质组学（LFQ）、PRM验证、qPCR验证及生物信息学分析，功能验证和机制验证明确。
主要模型
人THP-1巨噬细胞（经PMA分化及IFN-γ/LPS或IL-4/IL-13极化） 小鼠RAW264.7巨噬细胞（经IFN-γ/LPS或IL-4极化）
重点核对
THP-1分化用PMA浓度10 ng/ml处理24小时 THP-1 M1极化用IFN-γ 50 ng/ml和LPS 15 ng/ml处理48小时，M2极化用IL-4和IL-13各25 ng/ml处理72小时 RAW264.7 M1极化用IFN-γ 2.5 ng/ml和LPS 200 ng/ml处理24小时，M2极化用IL-4 10 ng/ml处理48小时 蛋白质组学显著差异阈值：变化倍数≥4（或≥2）且PSM≥5 qPCR使用三个生物学重复，采用2^-ΔΔCt法，P<0.05为显著
摘要
巨噬细胞在免疫系统中可极化为经典活化巨噬细胞（M1）和替代活化巨噬细胞（M2），分别发挥促炎和抗炎功能。人THP-1和小鼠RAW264.7细胞系模型已广泛用于各种巨噬细胞相关研究，然而这两种巨噬细胞模型之间蛋白质表达谱的异同仍不清楚。本研究利用基于质谱的蛋白质组学，系统研究了THP-1和RAW264.7巨噬细胞中M1和M2表型的蛋白质表达谱。通过定量分析两种细胞系不同巨噬细胞类型（M0、M1和M2）中超过5000种蛋白质，我们鉴定了一系列在每种巨噬细胞类型中独特上调的蛋白质，并进一步确认了43种在两种细胞系的M1巨噬细胞中共同上调的蛋白质。这些结果揭示了THP-1和RAW264.7巨噬细胞之间每种极化类型的显著差异。此外，CMPK2、RSAD2、DDX58和DHX58的mRNA和蛋白质表达在两种巨噬细胞模型的M1巨噬细胞中均强烈上调。这些数据可作为使用人和小鼠细胞系模型进一步研究实验病理学中巨噬细胞相关疾病的重要资源。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 人THP-1和小鼠RAW264.7巨噬细胞在M1和M2极化状态下蛋白质表达谱的异同是什么？
- 核心机制
- M1极化涉及干扰素信号通路、Toll样受体信号通路和防御反应，共同上调蛋白包括IFIT家族、GBP家族、ISG15等，其中CMPK2、RSAD2、DDX58和DHX58可能在M1极化中发挥核心作用。
- 主要证据
- 基于质谱的蛋白质组学鉴定超过5000种蛋白质，发现43种在两种细胞系M1巨噬细胞中共同上调；PRM验证了16种蛋白的上调，qPCR验证了CMPK2、RSAD2、DDX58和DHX58的mRNA上调。
- 研究意义
- 这些数据为发现人和小鼠巨噬细胞极化的共同生物标志物提供了重要参考，并有助于使用合适细胞模型进行相关疾病的临床前治疗开发。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
蛋白质组学样品制备和LC-MS/MS分析
全面鉴定和定量不同极化状态的蛋白质表达谱。
细胞裂解提取蛋白，酶解成肽段，进行LC-MS/MS分析，使用LFQ进行定量。
生物信息学分析
分析差异蛋白的功能和通路，筛选核心蛋白。
利用GO、KEGG、STRING、MCODE等工具进行富集分析和PPI网络构建，筛选核心蛋白。
PRM验证
通过靶向质谱验证全局蛋白质组学结果的准确性。
从43个共同上调蛋白中挑选16个，利用PRM进行靶向定量。
qPCR验证
验证核心蛋白在mRNA水平的表达趋势。
检测CMPK2、RSAD2、DDX58和DHX58在M0、M1、M2中的mRNA表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
验证蛋白表达变化
验证基因表达变化
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI 1640培养基 | HyClone | -- |
| DMEM培养基 | HyClone | -- | |
| 胎牛血清 | Biolnd | -- | |
| 青霉素-链霉素 | Solarbio | -- | |
| 佛波酯 | Beyotime | -- | |
| 干扰素-γ | Beyotime | -- | |
| 脂多糖 | Beyotime | -- | |
| 白细胞介素-4 | Beyotime | -- | |
| 白细胞介素-13 | Beyotime | -- | |
| 免疫荧光 | 抗iNOS抗体 | Servicebio | GB11119 |
| 抗MHC II抗体 | Bioss | bs-8481R | |
| 抗CD163抗体 | Bioss | bs-2527R | |
| 抗CD206抗体 | Bioss | bs-21473R | |
| Cy3偶联羊抗兔二抗 | Servicebio | GB21303 | |
| 羊抗兔Alexa Fluor 488二抗 | Servicebio | GB25303 | |
| DAPI | Solarbio | -- | |
| 倒置荧光显微镜CKX53 | Olympus | -- | |
| 蛋白提取 | BCA蛋白定量试剂盒 | Beyotime | -- |
| 二硫苏糖醇 | -- | -- | |
| 蛋白酶解 | 胰蛋白酶 | Promega | -- |
| 肽段脱盐 | HLB固相萃取柱 | Waters | -- |
| LC-MS/MS | Orbitrap Fusion Lumos质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| EASY-nanoLC 1200纳升液相色谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| nanoViper PepMap 100 C18预柱 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| nanoViper PepMap 100 C18分析柱 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 蛋白定量 | Proteome Discoverer 2.3 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 数据分析 | DAVID | -- | -- |
| Cytoscape | -- | -- | |
| STRING | -- | -- | |
| MCODE | -- | -- | |
| R语言 | -- | -- | |
| PRM | Skyline 20.1 | -- | -- |
| RNA提取 | RNA提取试剂盒 | Sangon Biotech | -- |
| 反转录 | 高容量cDNA反转录试剂盒 | TaKaRa | -- |
| qPCR | SYBR Green PCR预混液 | TaKaRa | -- |
| 快速实时荧光定量PCR系统 | Applied Biosystems | -- | |
| 引物 | GeneCreate | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养和极化 | 细胞系来源、培养基、血清浓度、极化刺激物（种类和浓度）、处理时间 阅读提示：Materials and Methods - Cell Culture and Stimulation |
| 免疫荧光验证 | 抗体种类、稀释比例、孵育时间和温度 阅读提示：Materials and Methods - Immunofluorescence |
| 蛋白提取和酶解 | 裂解缓冲液成分、超声条件、离心条件、酶解比例和时间 阅读提示：Materials and Methods - Cell Lysis and Protein Extraction |
| LC-MS/MS分析 | 色谱柱规格、梯度洗脱条件、质谱参数 阅读提示：Materials and Methods - LC–MS/MS Analysis |
| 蛋白质定量和筛选 | 蛋白鉴定和定量软件、数据库、显著差异蛋白阈值（倍数变化和PSM数） 阅读提示：Materials and Methods - Global Database Search and Protein Quantification; Results |
| PRM验证 | 目标蛋白选择、多肽选择、PRM参数 阅读提示：Materials and Methods - Parallel Reaction Monitoring |
| qPCR验证 | 引物序列、内参基因、生物学重复数、数据分析方法 阅读提示：Materials and Methods - RNA Extraction and qPCR |