BM-EPC的分离与培养
获取具有内皮祖细胞特性的细胞。
从大鼠股骨和胫骨骨髓中分离细胞，经密度梯度离心后，用含VEGF和bFGF的M199培养基培养，形成单层梭形细胞。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
骨髓来源内皮祖细胞片的构建及其旁分泌作用的初步研究
Construction and a preliminary study of paracrine effect of bone marrow-derived endothelial progenitor cell sheet.
实验完整度
中包含细胞分离培养、鉴定、功能实验（迁移、增殖、管形成）及机制验证（RT-qPCR、Western blot、ELISA），但缺少动物体内实验。
主要模型
大鼠骨髓来源内皮祖细胞（BM-EPC） BM-EPC细胞片
重点核对
大鼠品系：雄性Wistar大鼠，体重250-280g，8-10周龄。 细胞培养条件：M199培养基，10% FBS，20 ng/ml VEGF，1 ng/ml bFGF，5% CO2，37°C。 细胞片制备：接种1.5×10^6 cells于温敏培养板，37°C培养7天，25°C处理30分钟。 迁移实验：SDF-1α浓度梯度（0,1,10,100 ng/ml），5×10^4 cells。 管形成实验：2×10^4 cells接种于Matrigel包被96孔板，37°C培养4小时。
摘要
内皮祖细胞片释放旁分泌因子是组织修复的核心机制。本研究旨在构建大鼠骨髓来源内皮祖细胞片，并探讨基质细胞衍生因子-1α（SDF-1α）/CXCR4轴在BM-EPC片生物学功能中的作用。通过流式细胞术检测细胞表面标志物CD34/CD133/VE-cadherin/KDR以及双亲和力acLDL和UEA-1鉴定BM-EPC细胞。培养7天后，将BM-EPC单细胞悬液接种于温敏培养板以获取BM-EPC细胞片。采用RT-qPCR和western blot检测SDF-1α/CXCR4轴相关基因和蛋白的表达水平，并使用酶联免疫吸附试验测定细胞培养基中血管内皮生长因子、表皮生长因子和SDF-1α的浓度。成功获取BM-EPC细胞片。此外，与单细胞悬液相比，BM-EPC细胞片具有更好的迁移和管形成能力。当EPC片形成毛细血管样管时，VEGF、EGF和SDF-1α等旁分泌因子的释放增加。为揭示BM-EPC片管形成的机制，研究发现PI3K/AKT/eNOS通路的激活参与该过程，因为CXCR、PI3K、AKT和eNOS的磷酸化水平增加。BM-EPC细胞片比BM-EPC单细胞具有更好的旁分泌和管形成能力。其强大的分泌旁分泌因子能力可能与SDF-1α/CXCR4轴通过PI3K/AKT/eNOS通路有关。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 构建大鼠骨髓来源内皮祖细胞片，并探讨SDF-1α/CXCR4轴在BM-EPC片生物学功能（尤其是旁分泌和管形成能力）中的作用。
- 核心机制
- BM-EPC细胞片通过激活SDF-1α/CXCR4轴及下游PI3K/AKT/eNOS通路，促进VEGF、EGF和SDF-1α等旁分泌因子的分泌，从而增强管形成能力。
- 主要证据
- 体外实验显示，与单细胞相比，BM-EPC细胞片增殖和管形成能力增强；Western blot检测到p-CXCR4、p-PI3K、p-AKT和eNOS水平升高；ELISA检测到VEGF、EGF和SDF-1α分泌增加。
- 研究意义
- 细胞片技术保留了细胞间连接，优于传统单细胞移植，且BM-EPC细胞片具有更强的旁分泌能力，可能为缺血性疾病的细胞治疗提供新策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
BM-EPC的鉴定
验证分离细胞的表型特征。
通过流式细胞术检测CD34、CD133、VE-cadherin、KDR表达，并通过双荧光染色（DiI-acLDL和FITC-UEA-1）鉴定。
BM-EPC细胞片的构建与形态观察
利用温敏培养板获取完整细胞片。
将BM-EPC悬液接种于温敏培养板，37°C培养7天后降低温度至25°C处理30分钟，使细胞自发脱落形成细胞片，并观察形态和细胞外基质。
BM-EPC细胞片的迁移能力检测
评估SDF-1α对BM-EPC迁移的影响。
采用Transwell实验，将BM-EPC置于上室，下室加入不同浓度SDF-1α，培养1小时后染色并计数迁移细胞。
BM-EPC细胞片的增殖能力检测
比较细胞片与单细胞的增殖能力。
使用CCK-8试剂盒，在不同时间点（12h,24h,48h,72h）检测OD值。
BM-EPC细胞片的管形成能力检测
比较细胞片与单细胞的管形成能力。
将BM-EPC细胞片和单细胞分别接种于Matrigel包被的96孔板，培养4小时后计数管状结构数量。
SDF-1α/CXCR4轴相关基因和蛋白表达检测
探索细胞片增强功能的潜在机制。
通过RT-qPCR检测CXCR4、PI3K、AKT、eNOS的mRNA水平，通过Western blot检测CXCR4、p-CXCR4、PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、eNOS的蛋白水平。
旁分泌因子分泌水平检测
检测细胞片释放的旁分泌因子。
收集细胞培养上清，使用ELISA试剂盒检测VEGF、EGF、SDF-1α的浓度。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞分离 | Histopaque 1083 | Sigma | -- |
| 细胞培养 | M199培养基 | Gibco | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 青霉素-链霉素 | -- | -- | |
| 血管内皮生长因子 | Sigma | -- | |
| 碱性成纤维细胞生长因子 | Sigma | -- | |
| 纤连蛋白 | -- | -- | |
| 鉴定 | CD133抗体 | Proteintech | 18470-1-AP |
| CD34抗体 | Proteintech | 14486-1-AP | |
| VE-钙黏蛋白抗体 | Bioss | bs-4310R | |
| KDR抗体 | Proteintech | 26415-1-AP | |
| DiI标记的乙酰化低密度脂蛋白 | Molecular Probes | L-3484 | |
| FITC标记的荆豆凝集素1 | Sigma-Aldrich | L9006 | |
| DAPI | -- | -- | |
| 细胞片制备 | Thermo Scientific Nunc UpCell表面培养皿 | Thermo Scientific | -- |
| 玻连蛋白 | -- | -- | |
| 免疫荧光 | 抗I型胶原抗体 | Bioss | bs-0578R |
| Alexa Fluor 488二抗 | Proteintech | SA00006-2 | |
| 增殖检测 | 细胞计数试剂盒-8 | Dojindo Laboratories | -- |
| 管形成实验 | 基质胶 | Corning | -- |
| RT-qPCR | RNAiso Plus | TaKaRa Biotechnology | -- |
| PrimeScript逆转录试剂盒 | TaKaRa Biotechnology | -- | |
| SYBR Premix Ex Taq | TaKaRa Biotechnology | -- | |
| Western blot | BCA蛋白定量试剂盒 | TaKaRa | -- |
| PVDF膜 | Millipore | -- | |
| 抗CXCR4抗体 | Proteintech | 11073-1-AP | |
| 抗磷酸化CXCR4抗体 | Bioss | bs-12256R | |
| 抗PI3K抗体 | Abcam | ab86714 | |
| 抗磷酸化PI3K抗体 | Abcam | ab182651 | |
| 抗AKT抗体 | Proteintech | 10176-2-AP | |
| 抗磷酸化AKT抗体 | Proteintech | 66444-1-Ig | |
| 抗eNOS抗体 | Bioss | bs-20609R | |
| 抗微管蛋白抗体 | Proteintech | 10068-1-AP | |
| 辣根过氧化物酶标记二抗 | Proteintech | SA00001-2 | |
| Super ECL Plus试剂盒 | Applygen | -- | |
| ELISA | 大鼠SDF-1α ELISA试剂盒 | Quanzhou Konodi Biotechnology Co. Ltd | -- |
| 大鼠VEGF ELISA试剂盒 | Quanzhou Konodi Biotechnology Co. Ltd | -- | |
| 大鼠EGF ELISA试剂盒 | Quanzhou Konodi Biotechnology Co. Ltd | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物与伦理 | 动物品系、性别、体重、年龄；伦理批准号 阅读提示：Materials and methods: Animals |
| 细胞分离与培养 | 骨髓冲洗液体积；密度梯度离心参数（Histopaque浓度、离心力、时间）；培养基配方（M199、FBS浓度、VEGF和bFGF浓度）；培养条件（温度、CO2浓度、培养时间） 阅读提示：Materials and methods: Isolation and culturing of BM-EPCs |
| 细胞鉴定 | 流式细胞术所用抗体（CD34、CD133、VE-cadherin、KDR）及其稀释度；双荧光染色（DiI-acLDL浓度、FITC-UEA-1浓度、孵育时间） 阅读提示：Materials and methods: Identification of BM-EPCs by endothelial marker; Identification of BM-EPCs by immunochemistry |
| 迁移实验 | 细胞数量（5×10^4）；SDF-1α浓度（0、1、10、100 ng/ml）；培养时间（1小时）；染色方法（结晶紫浓度、时间） 阅读提示：Materials and methods: Transwell migration assay |
| 细胞片制备 | 接种密度（1.5×10^6）；培养温度和时间（37°C、7天）；降温处理（25°C、30分钟）；培养板类型（Thermo-Scientific Nunc UpCell） 阅读提示：Materials and methods: Fabrication of BM-EPC cell sheets |
| 增殖实验 | 细胞数量（5×10^3/well）；检测时间点（12、24、48、72小时）；CCK-8孵育时间（4小时）；检测波长（450 nm） 阅读提示：Materials and methods: Proliferation assay |
| 管形成实验 | 细胞数量（2×10^4）；Matrigel包被；培养时间（4小时）；计数方法 阅读提示：Materials and methods: Tube formation assay |
| RT-qPCR | 引物序列（表1）；RNA提取试剂；逆转录条件；扩增条件（95°C 30s，40循环95°C 5s,60°C 30s）；内参基因（β-actin） 阅读提示：Materials and methods: Reverse transcription-quantitative PCR (RT-qPCR) and Table 1 |
| Western blot | 蛋白提取量；抗体稀释度（CXCR4, P-CXCR4, PI3K, P-PI3K, AKT, P-AKT, eNOS, Tubulin）；封闭条件；孵育条件 阅读提示：Materials and methods: Western blot analysis |
| ELISA | 细胞数量（1×10^6）；培养条件（无生长因子M199+5% FBS，37°C, 5% CO2, 72小时）；所用ELISA试剂盒（SDF-1α, VEGF, EGF） 阅读提示：Materials and methods: ELISA assay |