建立细胞模型
筛选卵巢癌细胞系用于后续实验，并构建HE4和ANXA2稳定敲低的细胞系。
培养CAOV3、SKOV3和OVCAR3细胞，检测HE4、ANXA2和P-gp的基础表达。构建pSilencer 4.1-CMV neo载体，转染CAOV3细胞，筛选稳定敲低细胞系CAOV3-HE4-L（HE4 shRNA）和CAOV3-A2-L（ANXA2 shRNA）。
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人附睾蛋白4通过与其相互作用蛋白膜联蛋白II促进卵巢癌细胞P-糖蛋白介导的化疗耐药
Human epididymis protein 4 promotes P‑glycoprotein‑mediated chemoresistance in ovarian cancer cells through interactions with Annexin II.
实验完整度
高包括体外细胞模型、稳定转染敲低、抗体/活性蛋白干预、患者组织IHC和TCGA/GSEA分析，并含功能验证和机制探索。
主要模型
卵巢癌细胞系CAOV3、SKOV3和OVCAR3 稳定转染敲低细胞系CAOV3-HE4-L和CAOV3-A2-L 临床卵巢癌组织样本（52例） TCGA卵巢癌数据队列（374例）
重点核对
HE4、ANXA2和P-gp在三株卵巢癌细胞系中的本底表达水平 稳定转染细胞系CAOV3-HE4-L和CAOV3-A2-L的敲低效率及P-gp表达变化 HE4、ANXA2和P-gp之间的物理相互作用和共定位 外源性HE4/ANXA2活性蛋白或抗体处理对P-gp表达的影响 hsa-miR-129-5p在敲低细胞和不同处理中的表达变化
摘要
本研究旨在探讨人附睾蛋白4（HE4）对卵巢癌耐药的影响及其潜在机制。通过免疫共沉淀和免疫荧光实验检测蛋白间的相互作用。随后，构建了稳定转染HE4短发夹RNA（shRNA）和ANXA2 shRNA的细胞系CAOV3-HE4-L和CAOV3-A2-L。采用MTT法、免疫细胞化学、Western印迹、逆转录定量聚合酶链反应（RT-qPCR）和流式细胞术检测药物敏感性以及P-糖蛋白（P-gp）的表达和活性。通过免疫组织化学评估卵巢癌组织中HE4和P-gp的表达。利用生物信息学方法预测靶向P-gp基因ABCB1的microRNA，并通过RT-qPCR评估其表达。通过基因集富集分析（GSEA）筛选HE4、ANXA2和P-gp共有的信号通路。证实了HE4、ANXA2和P-gp之间的相互作用。P-gp表达分别与HE4和ANXA2表达呈正相关。此外，观察到在给予活性HE4蛋白后，CAOV3-A2-L细胞中P-gp表达无明显恢复。另外，在化疗耐药患者的卵巢癌组织中，HE4和P-gp的表达高于化疗敏感组（P<0.05）。此外，结果显示，在CAOV3-HE4-L和CAOV3-A2-L细胞中，随着HE4或ANXA2表达和P-gp表达的降低，hsa-miR-129-5p显著升高。GSEA分析显示，HE4、ANXA2和P-gp基因共同富集于肌动蛋白细胞骨架调控信号通路。这些结果表明，HE4通过与ANXA2的相互作用促进卵巢癌细胞P-gp介导的药物耐药，其潜在机制可能与hsa-miR-129-5p表达降低和肌动蛋白细胞骨架信号通路失调有关。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- HE4是否通过ANXA2相互作用调控P-gp介导的卵巢癌化疗耐药及其潜在机制。
- 核心机制
- HE4与ANXA2相互作用，上调P-gp表达，促进P-gp介导的化疗耐药，机制可能与抑制hsa-miR-129-5p表达及肌动蛋白细胞骨架信号通路失调有关。
- 主要证据
- 在CAOV3细胞中，敲低HE4或ANXA2降低P-gp表达和药物外排，增加阿霉素敏感性；外源活性HE4或ANXA2蛋白上调P-gp，而抗体阻断下调；临床组织样本中HE4和P-gp在耐药组高表达且正相关；GSEA显示三者共同富集于肌动蛋白细胞骨架通路。
- 研究意义
- 本研究首次在卵巢癌细胞中发现ANXA2与P-gp相互作用和共定位，为临床治疗耐药卵巢癌提供了新靶点，并为制定有效的新化疗方案提供了理论基础。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
检测蛋白表达与相互作用
确认HE4、ANXA2和P-gp在卵巢癌细胞中的表达情况及其相互作用。
用Western blot检测三株细胞中HE4、ANXA2、P-gp的表达；免疫细胞化学检测P-gp表达；通过免疫共沉淀（co-IP）和免疫荧光共定位分析HE4与ANXA2、ANXA2与P-gp的相互作用。
功能验证药物敏感性
探讨敲低HE4或ANXA2对卵巢癌细胞药物敏感性和P-gp功能的影响。
对CAOV3、CAOV3-Mock、CAOV3-HE4-L和CAOV3-A2-L细胞进行MTT实验检测阿霉素的IC50，流式细胞术检测细胞膜P-gp表达和阿霉素蓄积，并用P-gp抑制剂维拉帕米（VER）验证P-gp活性。
验证外源蛋白和抗体干预
验证HE4和ANXA2对P-gp表达的直接调控作用及ANXA2的必要性。
用HE4或ANXA2活性蛋白、相应抗体、IgG对照处理CAOV3细胞，并用HE4活性蛋白处理CAOV3-A2-L细胞，检测P-gp蛋白和mRNA表达。
临床组织验证
评估HE4和P-gp在化疗耐药和敏感卵巢癌组织中的表达及其与预后的关系。
对52例卵巢癌患者的组织进行IHC检测HE4和P-gp表达，分组为化疗耐药组和敏感组，分析表达差异、与临床病理参数的关系，并进行生存分析。
机制探索：miRNA预测与验证
探索HE4/ANXA2调控P-gp的可能机制，寻找靶向ABCB1的miRNA。
使用miRanda、TargetScan、DIANA和miRDB预测靶向ABCB1的miRNA，取交集；用RT-qPCR检测五个候选miRNA在敲低细胞中的表达，以及不同处理下hsa-miR-129-5p的表达变化。
机制探索：信号通路分析
鉴定HE4、ANXA2和P-gp共同参与的信号通路，提示耐药相关机制。
利用TCGA数据库下载卵巢癌数据，按HE4、ANXA2、ABCB1表达分组，进行GSEA分析，寻找共同富集的信号通路。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证分子表达变化
验证免疫效应
评估体内效果
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | McCoy's 5A改良培养基 | Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc. | -- |
| 胎牛血清 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | -- | |
| 细胞培养与转染 | pSilencer 4.1-CMV neo载体 | Ambion; Thermo Fisher Scientific, Inc. | -- |
| 细胞转染 | Lipofectamine LTX与Plus试剂 | Invitrogen; Thermo Fisher Scientific, Inc. | -- |
| 细胞培养与转染 | Opti-MEM培养基 | Invitrogen; Thermo Fisher Scientific, Inc. | -- |
| 稳定转染筛选 | G418 | Invitrogen; Thermo Fisher Scientific, Inc. | cat. no. 11811023 |
| Western blot | 兔抗人HE4抗体 | Abcam | ab109298 |
| 小鼠抗人ANXA2抗体 | ProteinTech Group, Inc. | 66035-1-Ig | |
| 兔抗人P-gp抗体 | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-8313 | |
| 小鼠抗人β-肌动蛋白抗体 | Beijing Biosynthesis Biotechnology Co., Ltd. | bsm-33036M | |
| 山羊抗兔二抗 | ZSGB-BIO | ZB-2301 | |
| 山羊抗小鼠二抗 | ZSGB-BIO | ZB-2305 | |
| 免疫细胞化学 | 兔抗人P-gp抗体 | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-8313 |
| 细胞培养（co-IP） | McCoy's 5A培养基 | Hyclone; Cytvia | SH30270.01 |
| 免疫共沉淀 | 兔抗人HE4抗体 | Abcam | ab109298 |
| 兔抗人ANXA2抗体 | Abcam | ab235939 | |
| 山羊抗人HE4抗体 | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc27570 | |
| 小鼠抗人P-gp抗体 | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc13131 | |
| 小鼠抗人ANXA2抗体 | ProteinTech Group, Inc. | 66035-1-Ig | |
| 兔IgG | BIOSS | bs-0295P | |
| Amersham ECL Prime Western印迹检测试剂 | Cytvia | RPN2232 | |
| 免疫荧光 | 异硫氰酸荧光素（FITC）绿色荧光标记兔IgG | Beijing Zhongshan Jinqiao Biotechnology Co., Ltd. | ZF-0314 |
| 四甲基罗丹明（TRITC）红色荧光标记小鼠IgG | Beijing Zhongshan Jinqiao Biotechnology Co., Ltd. | ZF-0316 | |
| 4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI） | Beyotime Institute of Biotechnology | C1002 | |
| RT-qPCR | RNAiso Plus试剂 | Takara Biotechnology Co., Ltd. | -- |
| PrimeScript RT试剂盒 | Takara Biotechnology Co., Ltd. | -- | |
| SYBR Premix Ex Taq™ | -- | -- | |
| 罗氏LightCycler系统 | Roche | -- | |
| MTT实验 | 阿霉素 | Meilun Biotechnology Co., Ltd. | MB1087-S |
| MTT（噻唑蓝四氮唑溴化物） | Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd. | -- | |
| 二甲基亚砜 | Beyotime Institute of Biotechnology | ST038 | |
| 流式细胞术（细胞表面P-gp检测） | 胰蛋白酶（0.25%） | Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc. | 25200-072 |
| 牛血清白蛋白（BSA） | Biological Industries | 04-011-1A/B | |
| PE标记的抗人P-gp单克隆抗体（克隆UIC2） | eBioscience; Thermo Fisher Scientific, Inc. | 12-2439 | |
| 流式细胞术（阿霉素蓄积） | 维拉帕米 | Nanjing SenBeiJia Biological Technology Co., Ltd. | 100223 |
| 外源蛋白和抗体阻断实验 | HE4外源活性蛋白 | Novoprotein | C550A |
| ANXA2外源活性蛋白 | Novoprotein | C205A | |
| HE4抗体 | Abcam | ab109298 | |
| ANXA2抗体 | ProteinTech Group, Inc. | 66035-1-Ig | |
| 免疫组织化学 | 兔抗人HE4抗体 | Abcam | ab109298 |
| 兔抗人P-gp抗体 | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-8313 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | 细胞系：CAOV3、SKOV3、OVCAR3；培养基：McCoy's 5A改良培养基，10%FBS；培养条件：37°C、5% CO2 阅读提示：Materials and methods, Cell culture and transfection |
| 稳定转染细胞系的构建 | 载体：pSilencer 4.1-CMV neo；转染试剂：Lipofectamine LTX with Plus；质粒用量：3.0 µg；筛选抗生素：G418（800 µg/ml），筛选时间：14天 阅读提示：Materials and methods, Cell culture and transfection |
| 蛋白间相互作用分析 | 抗体：抗HE4（ab109298）、抗ANXA2（66035-1-Ig）、抗P-gp（sc-8313、sc13131）、抗ANXA2（ab235939）；阴性对照：兔IgG；方法：co-IP和免疫荧光共定位 阅读提示：Materials and methods, Co-immunoprecipitation 和 Confocal laser scanning microscopy |
| 药物敏感性检测 | 药物：阿霉素（0-10 µg/ml），处理时间：24 h；MTT法：细胞数2000/孔，孵育4 h；IC50计算；平行复孔：3个，重复次数：3次 阅读提示：Materials and methods, MTT assay |
| P-gp表达和功能检测 | 细胞数量：0.2 × 10^6（表面染色）、5 × 10^5（蓄积）；抗体：PE标记抗P-gp（UIC2）；抑制剂：维拉帕米（50 µM，预处理1 h）；阿霉素浓度：10 µM，孵育60 min；流式细胞仪 阅读提示：Materials and methods, Assessment of P-gp expression on the cell surface 和 Measurement of adriamycin accumulation by flow cytometry |
| 外源蛋白和抗体干预 | 蛋白浓度：HE4活性蛋白100 ng/ml，ANXA2活性蛋白10 ng/ml；抗体浓度：10 µg/ml；处理时间：0、12、24 h；细胞系：CAOV3和CAOV3-A2-L 阅读提示：Materials and methods, Antibody blocking and exogenous active protein supplementation tests |
| 临床组织样本分析 | 样本量：52例卵巢癌组织，包括不同组织学类型；分组：化疗耐药组（23例）和化疗敏感组（29例）；IHC抗体：抗HE4（1:40）、抗P-gp（1:50）；判读标准：高表达（++/+++）和低表达（−/+） 阅读提示：Materials and methods, IHC |
| miRNA表达分析 | 候选miRNA：hsa-miR-129-5p、hsa-miR-4282、hsa-miR-4778-5p、hsa-miR-4708-3p、hsa-miR-4432；RT-qPCR内参：RNU6-2；数据处理：2^−ΔΔCq方法 阅读提示：Materials and methods, RT-qPCR 和 Results, Inhibitory regulation of hsa-miR-129-5p |
| TCGA数据获取与GSEA | 数据来源：TCGA卵巢癌数据（GDC API），纳入样本数：374例；分组：按表达分组，前25%为低表达，后25%为高表达；GSEA软件：GSEA 3.0；基因集：C2.cp.kegg.v6.1.symbols.gmt；显著性阈值：FDR<0.25，P<0.05 阅读提示：Materials and methods, Data collection from TCGA database and GSEA |