建立大鼠脊髓损伤模型
模拟脊髓损伤,用于后续蛋白质组学分析
使用路易斯维尔损伤系统装置对T10节段进行撞击,造成轻、中、重度损伤(0.6、1.0、1.8 mm深度),n=9/组。
Spastin interacts with collapsin response mediator protein 3 to regulate neurite growth and branching.
包含蛋白质组学、LC-MS、GST pull-down、免疫共沉淀、细胞共转染等多项体外实验,以及大鼠SCI模型体内验证,证据层级多。
大鼠脊髓损伤模型 原代海马神经元
大鼠SCI模型:T10节段损伤,损伤深度0.6、1.0、1.8 mm (轻、中、重度),n=9/组 原代海马神经元:出生1天大鼠,以1×10^4 cells/cm^2接种,Neurobasal-A培养基 共转染实验:培养48小时后,用磷酸钙法转染,转染后24小时观察 CRMP3-siRNA敲低效率约92%(参考文献)
提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
模拟脊髓损伤,用于后续蛋白质组学分析
使用路易斯维尔损伤系统装置对T10节段进行撞击,造成轻、中、重度损伤(0.6、1.0、1.8 mm深度),n=9/组。
鉴定与脊髓损伤相关的差异表达蛋白
对损伤后72小时的脊髓组织进行LC-MS分析,结合IPA和PLGEM分析,鉴定出214个差异表达蛋白,筛选出CRMP3作为下调蛋白。
验证CRMP3是否与spastin直接结合
通过GST pull-down、LC-MS、免疫共沉淀和免疫荧光共定位实验,证实CRMP3与spastin在体外和体内相互作用。
评估CRMP3和spastin对神经突生长和分支的影响
将原代海马神经元共转染CRMP3-GFP和Spastin-mCherry,或对照组,测量神经突长度和分支数量。
按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 动物实验 | 庆大霉素 | Chongqing Xianfeng Animal Pharmaceutical Co. Ltd. | -- |
| 蛋白质组学 | NuPAGE 4-12%凝胶 | Life Technologies | -- |
| 胶体蓝染色试剂盒 | Life Technologies | -- | |
| 高效液相色谱Ultimate 5600系统 | AB SCIEX | -- | |
| 线性离子阱 | ThermoElectron | -- | |
| 免疫组织化学 | 链霉亲和素-生物素复合物试剂盒 | Jiehao | -- |
| 抗CRMP3抗体 | Bioss | bs-11821R | |
| 抗spastin抗体 | Abcam | ab77144 | |
| 抗胶质纤维酸性蛋白抗体 | Servicebio | GB12096 | |
| 抗髓鞘碱性蛋白抗体 | Servicebio | GB13226 | |
| 山羊抗小鼠IgG多克隆二抗,Alexa Fluor 555 | Abcam | ab150118 | |
| 山羊抗兔IgG多克隆二抗,Alexa Fluor 488 | Abcam | ab150077 | |
| 辣根过氧化物酶抗兔IgG | Fuzhou Maixin | KIT-5004 | |
| 显微镜检查 | 显微镜 | Olympus | -- |
| 图像分析 | Image Pro Plus 6.0 | Media Cybernetics | -- |
| 分子克隆 | pEGFP-C1 | Clontech | -- |
| pGEX-5x-3 | Amersham Pharmacia Biotech | -- | |
| pCMV-Tag2 | Stratagene | -- | |
| siRNA合成 | siRNA Spastin | Shanghai GenePharma | -- |
| siRNA NC | Shanghai GenePharma | -- | |
| GST pull-down | GST-琼脂糖珠 | Invitrogen | -- |
| Western blot | RIPA裂解液 | Roche | -- |
| 蛋白酶和磷酸酶抑制剂 | Roche | -- | |
| SDS-PAGE凝胶4-12% | Sigma-Aldrich | V900859 | |
| ECL-Prime试剂 | Amersham | -- | |
| 抗GAPDH抗体 | Servicebio | GB12002 | |
| 抗CRMP3抗体 | Bioss | bs-11821R | |
| 抗spastin抗体 | Abcam | ab77144 | |
| HRP标记的山羊抗兔二抗 | Abclonal Technology | AS014 | |
| HRP标记的山羊抗小鼠二抗 | Abclonal Technology | AS003 | |
| 抗GFP抗体 | Abcam | ab290 | |
| 细胞培养 | 胰蛋白酶 | Gibco | 25200-072 |
| 多聚-D-赖氨酸 | Gibco | P6407 | |
| Neurobasal-A培养基 | Gibco | 10888-022 | |
| B27添加剂 | Gibco | 17504044 | |
| 谷氨酰胺 | Gibco | 25030149 | |
| CO2培养箱 | Thermo | -- | |
| 细胞形态学 | 共聚焦显微镜LSM 700 | Zeiss | -- |
| Image-Pro Plus | Media Cybernetics | -- | |
| 统计分析 | SPSS v22.0 | IBM Corp. | -- |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物模型 | 大鼠品系、性别、体重、年龄;手术方式(T10全椎板切除术);损伤装置参数(撞击深度、时间、压力);分组(sham和SCI,n=9/组) 阅读提示:参见Materials and Methods中的Animals和SCI modeling部分 |
| 蛋白质组学 | 样本来源(T10节段脊髓);时间点(术后72小时);LC-MS仪器和参数;数据库和筛选标准(差异表达蛋白数,CRMP3表达变化) 阅读提示:参见Materials and Methods中的Liquid chromatography-mass spectrometry, Ingenuity pathway analysis and power law global error model analysis以及Figure 2-4 |
| 蛋白相互作用验证 | GST融合蛋白的构建和纯化;pull-down实验条件(裂解液、孵育时间、洗涤次数);免疫共沉淀的抗体和裂解缓冲液;免疫荧光共定位的抗体和定量方法 阅读提示:参见Materials and Methods中的GST pull-down assays, Western blot assays and co-immunoprecipitation, 以及Figure 5-6 |
| 细胞实验 | 原代海马神经元来源(1日龄大鼠);种植密度;转染方法(磷酸钙法);质粒和siRNA序列;观察时间(转染后24小时);神经突长度和分支的测量标准 阅读提示:参见Materials and Methods中的Cell culture and transfection, Cell morphology, 以及Figure 7 |