Spastin与collapsin response mediator protein 3相互作用以调节神经突生长和分支

Spastin interacts with collapsin response mediator protein 3 to regulate neurite growth and branching.

作者信息Zhi-Sheng Ji, Jian-Ping Li, Chao-Hua Fu, Jian-Xian Luo, Hua Yang, Guo-Wei Zhang, Wutian Wu, Hong-Sheng Lin
PMID33907047
发布时间2021-12
DOI10.4103/1673-5374.313052

实验完整度

包含蛋白质组学、LC-MS、GST pull-down、免疫共沉淀、细胞共转染等多项体外实验,以及大鼠SCI模型体内验证,证据层级多。

主要模型

大鼠脊髓损伤模型 原代海马神经元

重点核对

大鼠SCI模型:T10节段损伤,损伤深度0.6、1.0、1.8 mm (轻、中、重度),n=9/组 原代海马神经元:出生1天大鼠,以1×10^4 cells/cm^2接种,Neurobasal-A培养基 共转染实验:培养48小时后,用磷酸钙法转染,转染后24小时观察 CRMP3-siRNA敲低效率约92%(参考文献)

摘要

细胞骨架微管的重排和运动在脊髓损伤的修复中至关重要。Spastin在微管切割的调节中发挥重要作用。Spastin和collapsin response mediator proteins均能调节神经突的生长和分支;然而,在此过程中spastin是否与collapsin response mediator protein 3(CRMP3)相互作用尚不清楚,CRMP3参与脊髓损伤修复的机制也未知。在本研究中,我们使用蛋白质组学方法鉴定了与脊髓损伤修复相关的关键蛋白。然后,我们采用液相色谱-质谱联用技术鉴定了能够与谷胱甘肽S-转移酶-spastin相互作用的蛋白。接着,使用免疫共沉淀和染色方法评估spastin和CRMP3之间的潜在相互作用。最后,我们将CRMP3和spastin共转染原代海马神经元,以评估它们在神经突生长中的作用。质谱鉴定了CRMP3在脊髓损伤修复过程中的作用。液相色谱-质谱联用pull-down实验鉴定了三个能够与spastin相互作用的CRMP3肽段。CRMP3和spastin在脊髓中共表达,并在体外和体内能够相互相互作用。最后,CRMP3过表达能够增强spastin促进神经突生长和分支的能力。因此,我们的结果证实spastin和CRMP3通过调节神经突生长和分支在脊髓损伤修复中发挥作用。这些蛋白可能因此成为脊髓损伤修复的新靶点。暨南大学实验动物护理和使用委员会于2018年10月8日批准了这项研究(批准号:IACUS-20181008-03)。

实验结论

提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。

研究问题
spastin是否与CRMP3相互作用,以及这种相互作用在脊髓损伤修复中对神经突生长和分支的影响
核心机制
CRMP3与spastin直接相互作用,协同调节微管动力学,从而促进神经突生长和分支。
主要证据
蛋白质组学和LC-MS鉴定CRMP3为脊髓损伤相关蛋白;GST pull-down和免疫共沉淀证实spastin与CRMP3在体外和体内直接结合;原代海马神经元共转染实验显示CRMP3增强spastin促进神经突分支和生长的能力。
研究意义
作者提出spastin和CRMP3可能成为脊髓损伤修复的新靶点。

研究路径

按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

1

建立大鼠脊髓损伤模型

模拟脊髓损伤,用于后续蛋白质组学分析

使用路易斯维尔损伤系统装置对T10节段进行撞击,造成轻、中、重度损伤(0.6、1.0、1.8 mm深度),n=9/组。

2

蛋白质组学分析

鉴定与脊髓损伤相关的差异表达蛋白

对损伤后72小时的脊髓组织进行LC-MS分析,结合IPA和PLGEM分析,鉴定出214个差异表达蛋白,筛选出CRMP3作为下调蛋白。

3

验证CRMP3与spastin的相互作用

验证CRMP3是否与spastin直接结合

通过GST pull-down、LC-MS、免疫共沉淀和免疫荧光共定位实验,证实CRMP3与spastin在体外和体内相互作用。

4

细胞功能实验

评估CRMP3和spastin对神经突生长和分支的影响

将原代海马神经元共转染CRMP3-GFP和Spastin-mCherry,或对照组,测量神经突长度和分支数量。

研究方法

按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。

产品清单

实验环节名称品牌货号
庆大霉素Chongqing Xianfeng Animal Pharmaceutical Co. Ltd.--
NuPAGE 4-12%凝胶Life Technologies--
胶体蓝染色试剂盒Life Technologies--
高效液相色谱Ultimate 5600系统AB SCIEX--
线性离子阱ThermoElectron--
链霉亲和素-生物素复合物试剂盒Jiehao--
抗CRMP3抗体Biossbs-11821R
抗spastin抗体Abcamab77144
抗胶质纤维酸性蛋白抗体ServicebioGB12096
抗髓鞘碱性蛋白抗体ServicebioGB13226
山羊抗小鼠IgG多克隆二抗,Alexa Fluor 555Abcamab150118
山羊抗兔IgG多克隆二抗,Alexa Fluor 488Abcamab150077
辣根过氧化物酶抗兔IgGFuzhou MaixinKIT-5004
显微镜Olympus--
Image Pro Plus 6.0Media Cybernetics--
pEGFP-C1Clontech--
pGEX-5x-3Amersham Pharmacia Biotech--
pCMV-Tag2Stratagene--
siRNA SpastinShanghai GenePharma--
siRNA NCShanghai GenePharma--
GST-琼脂糖珠Invitrogen--
RIPA裂解液Roche--
蛋白酶和磷酸酶抑制剂Roche--
SDS-PAGE凝胶4-12%Sigma-AldrichV900859
ECL-Prime试剂Amersham--
抗GAPDH抗体ServicebioGB12002
抗CRMP3抗体Biossbs-11821R
抗spastin抗体Abcamab77144
HRP标记的山羊抗兔二抗Abclonal TechnologyAS014
HRP标记的山羊抗小鼠二抗Abclonal TechnologyAS003
抗GFP抗体Abcamab290
胰蛋白酶Gibco25200-072
多聚-D-赖氨酸GibcoP6407
Neurobasal-A培养基Gibco10888-022
B27添加剂Gibco17504044
谷氨酰胺Gibco25030149
CO2培养箱Thermo--
共聚焦显微镜LSM 700Zeiss--
Image-Pro PlusMedia Cybernetics--
SPSS v22.0IBM Corp.--

关键环节

汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

环节核对要点
动物模型
大鼠品系、性别、体重、年龄;手术方式(T10全椎板切除术);损伤装置参数(撞击深度、时间、压力);分组(sham和SCI,n=9/组)
阅读提示:参见Materials and Methods中的Animals和SCI modeling部分
蛋白质组学
样本来源(T10节段脊髓);时间点(术后72小时);LC-MS仪器和参数;数据库和筛选标准(差异表达蛋白数,CRMP3表达变化)
阅读提示:参见Materials and Methods中的Liquid chromatography-mass spectrometry, Ingenuity pathway analysis and power law global error model analysis以及Figure 2-4
蛋白相互作用验证
GST融合蛋白的构建和纯化;pull-down实验条件(裂解液、孵育时间、洗涤次数);免疫共沉淀的抗体和裂解缓冲液;免疫荧光共定位的抗体和定量方法
阅读提示:参见Materials and Methods中的GST pull-down assays, Western blot assays and co-immunoprecipitation, 以及Figure 5-6
细胞实验
原代海马神经元来源(1日龄大鼠);种植密度;转染方法(磷酸钙法);质粒和siRNA序列;观察时间(转染后24小时);神经突长度和分支的测量标准
阅读提示:参见Materials and Methods中的Cell culture and transfection, Cell morphology, 以及Figure 7