Tetrandrine Ameliorates Myocardial Ischemia Reperfusion Injury through miR-202-5p/TRPV2.
包含细胞H/R模型和动物I/R模型两个独立证据层级，并通过miR-202-5p抑制剂进行功能验证和机制验证。
H9C2心肌细胞H/R模型 Sprague-Dawley大鼠I/R模型
Tet处理浓度：细胞1.5 μmol/L，动物50 mg/kg H/R条件：缺氧120 min（95% N2/5% CO2），复氧30 min（95% O2/5% CO2） 动物I/R模型：结扎左前降支冠状动脉30 min，再灌注120 min miR-202-5p inhibitor转染：Lipofectamine 2000处理48 h 动物分组：假手术组、I/R组、I/R+Tet组、I/R+Tet+NC组、I/R+Tet+miR-202-5p inhibitor组
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
建立心肌细胞缺氧/复氧损伤模型，并观察Tet处理对miR-202-5p和TRPV2表达的影响。
H9C2细胞分为对照组、H/R组、H/R+Tet组、H/R+Tet+NC组、H/R+Tet+miR-202-5p inhibitor组。H/R组进行缺氧120分钟和复氧30分钟处理。Tet组在H/R后以1.5 μmol/L Tet处理48小时。miR-202-5p inhibitor及NC通过Lipofectamine 2000转染48小时。
验证Tet对H/R诱导的miR-202-5p/TRPV2轴和心肌细胞凋亡的影响。
通过RT-qPCR检测miR-202-5p和TRPV2 mRNA表达，Western blot检测TRPV2、cleaved caspase3、Bax、Bcl-2等蛋白表达，流式细胞术检测细胞凋亡，CCK-8检测细胞活力。
在整体动物水平验证Tet对心肌I/R损伤的保护作用及机制。
25只雄性SD大鼠随机分为5组：假手术组、I/R组、I/R+Tet组（50 mg/kg）、I/R+Tet+NC组、I/R+Tet+miR-202-5p inhibitor组。通过结扎左前降支冠状动脉30分钟再灌注120分钟建立I/R模型。Tet通过尾静脉注射50 mg/kg，miR-202-5p inhibitor或NC在结扎前48小时尾静脉注射。
评估Tet对I/R大鼠心肌损伤、梗死面积和细胞凋亡的影响。
通过RT-qPCR检测心肌组织中miR-202-5p和TRPV2 mRNA表达，Western blot检测TRPV2和凋亡相关蛋白，免疫组化检测TRPV2蛋白，ELISA检测血清CK-MB和LDH，H&E染色观察病理变化，Evans blue-TCC染色检测梗死面积，TUNEL染色检测细胞凋亡。
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 杜氏改良Eagle培养基 | Hyclone | SH30243.01B |
| 胎牛血清 | Hyclone | SH30084.03 | |
| 细胞转染 | Lipofectamine 2000转染试剂 | -- | -- |
| RNA提取 | Takara通用RNA提取试剂盒 | Takara | 9767 |
| 细胞活性检测 | CCK-8检测试剂盒 | Dojindo | -- |
| 流式凋亡检测 | 凋亡检测试剂盒 | Vazyme | -- |
| 流式细胞术 | 流式细胞仪CytoFLEX S | Beckman | -- |
| 蛋白提取 | RIPA裂解液 | Beyotime | P0013B |
| 蛋白定量 | BCA蛋白定量检测试剂盒 | Beyotime | P0009 |
| Western blot | 抗TRPV2抗体 | Bioss | BS-10297R |
| 抗caspase3抗体 | AFFINITY | AF7022 | |
| 抗pro-caspase3抗体 | Proteintech | 19677-1-AP | |
| 抗Bax抗体 | Proteintech | 60267-1-Ig | |
| 抗Bcl-2抗体 | Proteintech | 12789-1-AP | |
| 抗GAPDH抗体 | Proteintech | 60004-1-Ig | |
| ELISA | 乳酸脱氢酶（LDH）检测试剂盒 | Jiancheng | A020-2 |
| 肌酸激酶同工酶MB（CK-MB）检测试剂盒 | Jiancheng | E0061-1 | |
| H&E染色 | 苏木素 | Proteintech | -- |
| 伊红 | Sigma | -- | |
| 光学显微镜OLYMPUS BX53 | Olympus | -- | |
| Evans blue-TTC染色 | 伊文思蓝染料 | Solarbio | -- |
| 三苯基氯化四氮唑（TTC） | Sigma | T8877-25G | |
| TUNEL染色 | TUNEL凋亡检测试剂盒 | AtaGenix | ATK00001 |
| 免疫组化 | 山羊血清 | Beyotime | C0265 |
| 辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG抗体 | AtaGenix | ATPA00025Go |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养及H/R处理 | H9C2细胞系；培养基为DMEM+10% FBS；H/R条件：缺氧120 min（95% N2/5% CO2）和复氧30 min（95% O2/5% CO2）；Tet浓度1.5 μmol/L处理48 h 阅读提示：Materials and Methods 2.1 Cell Culture |
| 药物处理 | Tet处理浓度和时间：H9C2细胞1.5 μmol/L 48 h；大鼠50 mg/kg尾静脉注射 阅读提示：Methods 2.1 和 2.7 |
| 细胞转染 | miR-202-5p inhibitor及NC转染试剂为Lipofectamine 2000，转染时间48 h 阅读提示：Methods 2.1 Cell Culture |
| 动物模型建立 | SD大鼠（雄性，220-250 g）分组：假手术、I/R、I/R+Tet、I/R+Tet+NC、I/R+Tet+miR-202-5p inhibitor；I/R模型：结扎左前降支冠状动脉30 min，再灌注120 min；Tet剂量50 mg/kg；miR-202-5p inhibitor或NC在结扎前48 h尾静脉注射 阅读提示：Methods 2.7 Animals |
| 心肌梗死面积检测 | Evans blue-TTC染色步骤：注射Evans blue染料，切片后用2% TTC 37°C孵育15 min 阅读提示：Methods 2.8 Hematoxylin-Eosin (H&E) and Evans Blue-TCC Staining |
| 凋亡检测 | TUNEL染色步骤：使用TUNEL检测试剂盒，DAPI复染；流式细胞术使用Annexin V-FITC/PI双染 阅读提示：Methods 2.4 和 2.9 |
