检测miR-7在LPS刺激下的表达变化
探究miR-7是否参与TLR4信号通路。
用不同浓度LPS处理BMDMs和RAW 264.7细胞，在不同时间点通过RT-qPCR检测miR-7表达水平。
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microRNA-7通过FAM177A负性调控Toll样受体4信号通路
MicroRNA-7 negatively regulates Toll-like receptor 4 signaling pathway through FAM177A.
实验完整度
高包括细胞模型（BMDMs、RAW264.7）、基因敲除小鼠、功能获得与缺失实验、靶基因验证（荧光素酶报告基因）、RNA-seq及回补实验等多个独立证据层级。
主要模型
骨髓来源巨噬细胞（BMDMs） RAW 264.7巨噬细胞系 miR-7缺陷小鼠（C57BL/6背景） HEK 293T细胞
重点核对
miR-7缺陷对LPS诱导BMDMs炎症因子（IL-1β、IL-6、IL-12、TNF-α）表达的影响 miR-7过表达对RAW 264.7细胞TLR4信号通路的影响 FAM177A是否为miR-7的直接靶基因（荧光素酶报告基因） FAM177A敲低对TLR4信号通路的影响 FAM177A敲低对miR-7缺陷BMDMs表型的逆转作用
摘要
在本研究中，我们发现经LPS刺激的TLR4信号激活的骨髓来源巨噬细胞（BMDMs）中miR-7的表达显著增加。重要的是，miR-7缺陷显著增强了LPS激活的BMDMs中相关炎症细胞因子（包括IL-1β、IL-6和IL-12以及TNF-α）的产生，并伴随着TLR4信号转导（包括Myd88依赖和Myd88非依赖通路）的增强，而miR-7过表达则显著降低TLR4信号的转导和相关炎症细胞因子的产生。机制上，我们鉴定了FAM177A作为miR-7的一个新靶分子。此外，通过RNAi下调FAM177A可损害TLR4信号的转导。最后，下调FAM177A也逆转了miR-7缺陷对BMDMs TLR4信号转导和相关炎症细胞因子产生的影响。因此，我们提供了新的证据，表明miR-7通过靶向FAM177A作为调控TLR4信号通路的新型负性微调因子，这可能有助于基础理解TLR4信号的调控机制，并有利于针对相关临床疾病的治疗策略的开发。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- miR-7在TLR4信号通路中发挥何种作用及其分子机制？
- 核心机制
- miR-7通过直接靶向FAM177A的3'UTR（1467-1473位点）负性调控TLR4信号通路，抑制MyD88依赖和非依赖途径的信号转导及下游炎症因子的产生。
- 主要证据
- miR-7缺陷增强LPS诱导的炎症因子表达和TLR4信号分子磷酸化；miR-7过表达则相反；FAM177A被鉴定为miR-7直接靶基因，且FAM177A敲低抑制TLR4信号并逆转miR-7缺陷的表型。
- 研究意义
- 首次揭示miR-7作为TLR4信号的负性调控因子，通过靶向FAM177A发挥作用，加深对TLR4信号调控机制的理解，并为相关炎症性疾病治疗策略的开发提供潜在靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
miR-7缺陷对TLR4信号的影响
验证miR-7缺失是否影响LPS诱导的炎症反应。
比较miR-7缺陷小鼠和WT小鼠来源的BMDMs在LPS刺激后炎症因子表达和TLR4信号通路分子的变化。
miR-7过表达对TLR4信号的影响
验证miR-7过表达是否抑制TLR4信号。
用携带miR-7的慢病毒感染RAW 264.7细胞，筛选稳定株，检测LPS刺激后炎症因子和信号分子表达。
鉴定FAM177A为miR-7的靶基因
寻找miR-7调控TLR4信号的分子靶点。
通过RNA-seq分析miR-7缺陷与WT BMDMs的基因表达差异，结合生物信息学预测，并通过荧光素酶报告基因验证FAM177A为直接靶标。
FAM177A敲低对TLR4信号的影响
验证FAM177A是否参与miR-7对TLR4信号的调控。
用FAM177A shRNA慢病毒感染RAW 264.7细胞，检测LPS刺激后TLR4信号和炎症因子的变化。
FAM177A敲低对miR-7缺陷BMDMs的逆转作用
验证FAM177A是miR-7缺陷表型的关键下游分子。
在miR-7缺陷BMDMs中敲低FAM177A，检测TLR4信号和炎症因子的变化。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 低糖DMEM培养基 | Life Technologies | -- |
| 红细胞裂解液 | Solarbio | -- | |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 | PeproTech | -- | |
| RPMI-1640培养基 | Gibco | -- | |
| 青霉素 | -- | -- | |
| 链霉素 | -- | -- | |
| LPS刺激 | 脂多糖（大肠杆菌0111:B4） | Sigma | -- |
| 磷酸盐缓冲液 | -- | -- | |
| RNA提取 | RNAiso Plus试剂 | Takara | -- |
| Eppendorf BioSpectrometer分光光度计 | Eppendorf | -- | |
| RT-qPCR | TaqMan MicroRNA逆转录试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| S1000TM热循环PCR扩增仪 | Bio-Rad | -- | |
| TaqMan miR-7探针 | Life Technologies | 4426961 | |
| C1000TM热循环实时定量PCR扩增仪 | Bio-Rad | -- | |
| PrimeScript RT试剂盒 | Takara | -- | |
| SYBR Premix Ex Taq II | Takara | -- | |
| 慢病毒感染 | 慢病毒miR-7 | GenePharma | -- |
| 阴性对照慢病毒 | GenePharma | -- | |
| 聚凝胺 | -- | -- | |
| 嘌呤霉素 | Meilun Biotechnology Co. | -- | |
| shRNA-FAM177A慢病毒 | GenePharma | -- | |
| 阴性对照shRNA慢病毒 | GenePharma | -- | |
| 细胞转染 | Lipofectamine 3000转染试剂 | Invitrogen | -- |
| ELISA | ELISA试剂盒（IL-1β、IL-6、IL-12、TNF-α） | eBioscience | -- |
| 荧光素酶报告基因实验 | pmirGLO质粒 | -- | -- |
| 双荧光素酶报告基因检测系统 | Promega | -- | |
| Western blot | 高效RIPA裂解液 | Solarbio | R0010 |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Solarbio | -- | |
| PVDF膜 | Bio-Rad | -- | |
| 抗MyD88抗体 | Abcam | ab34710 | |
| 抗TRIF抗体 | Abcam | ab13810 | |
| 抗TRAF6抗体 | Abcam | ab137452 | |
| 抗Erk1/2抗体 | Abcam | ab184699 | |
| 抗磷酸化Erk1/2抗体 | Abcam | ab201015 | |
| 抗JNK抗体 | Abcam | ab124956 | |
| 抗磷酸化JNK抗体 | Abcam | ab179461 | |
| 抗NF-κB抗体 | Abcam | ab16502 | |
| 抗磷酸化NF-κB抗体 | Abcam | ab97726 | |
| 抗TLR4抗体 | Cell Signaling Technology | cst14358 | |
| 抗Akt抗体 | Cell Signaling Technology | cst4691 | |
| 抗磷酸化Akt抗体 | Cell Signaling Technology | cst4511 | |
| 抗GAPDH抗体 | Cell Signaling Technology | cst4060 | |
| 抗FAM177A抗体 | Biorbyt | orb477678 | |
| HRP标记二抗 | Cell Signaling Technology | -- | |
| 免疫荧光 | Image-iT固定/透化试剂盒 | Life Technologies | -- |
| 抗FAM177A抗体（bs-14764R） | Bioss | bs-14764R | |
| Alexa Fluor 488标记的抗兔IgG | Cell Signaling Technology | -- | |
| 含DAPI的Prolong Gold防淬灭剂 | Invitrogen | -- | |
| Leica TCS SP8 X共聚焦显微镜 | Leica | -- | |
| RNA测序 | RNA测序 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| BMDM诱导与培养 | 小鼠周龄（8-10周）、GM-CSF浓度（20 ng/ml）、培养时间（7天）、细胞接种密度（1.5×106-2×106 cells/well） 阅读提示：Materials and Methods: Induction and culture of bone marrow-derived macrophages (BMDMs) |
| LPS刺激 | LPS浓度（100 ng/ml）、处理时间（12 h）、LPS来源（Escherichia coli 0111:B4, Sigma） 阅读提示：Materials and Methods: LPS-induced cellular inflammation model; Figure legends (Figures 1-6) |
| miR-7过表达/敲低 | 慢病毒MOI（10）、Polybrene浓度（8 μg/ml）、嘌呤霉素筛选浓度（6 μg/ml）、筛选时间（15天） 阅读提示：Materials and Methods: Recombinant lentiviruses and infection |
| 荧光素酶报告基因实验 | HEK 293T细胞、miR-7 mimics浓度（100 nM）、转染时间（48 h）、报告基因质粒（pFAM177A-WT/Mut） 阅读提示：Materials and Methods: Plasmid construction and luciferase reporter assay |
| Western blot检测 | 蛋白上样量（40 μg）、SDS-PAGE凝胶浓度（10%）、转膜时间（2 h）、电压（200 V）、一抗稀释比例（未明确） 阅读提示：Materials and Methods: Western blotting |
| 统计方法与重复数 | 独立实验次数（至少3次）、统计方法（非配对t检验、单因素方差分析）、显著性水平（p < 0.05） 阅读提示：Materials and Methods: Statistical analyses |