CRISPR全基因组筛选鉴定CHK1抑制剂耐药基因
鉴定敲除后能赋予细胞CHK1抑制剂耐药性的基因。
在A549和NCI-H460细胞中感染Brunello sgRNA文库，用prexasertib筛选19天，通过STARS算法分析富集的sgRNA。
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CHK1抑制剂阻断FAM122A磷酸化并促进复制应激
CHK1 Inhibitor Blocks Phosphorylation of FAM122A and Promotes Replication Stress.
实验完整度
高包含CRISPR筛选、细胞功能实验、生化机制验证及临床样本分析等多个独立证据层级，并进行了功能验证和机制验证。
主要模型
A549和NCI-H460非小细胞肺癌细胞系 U2OS细胞系 ES2卵巢癌细胞系 293T细胞
重点核对
FAM122A敲除或敲低在多种细胞系中诱导CHK1抑制剂（prexasertib和SRA737）和ATR抑制剂（VE822）耐药 FAM122A敲除通过激活PP2A-B55α稳定WEE1蛋白，减少复制应激，恢复G2/M检查点 CHK1在Ser37位点直接磷酸化FAM122A，磷酸化导致FAM122A与PP2A-B55α复合物分离并与14-3-3蛋白结合 CHK1抑制剂和WEE1抑制剂联用可克服FAM122A缺失引起的CHK1抑制剂耐药 FAM122A表达水平与CHK1抑制剂敏感性相关，低表达预测耐药
摘要
虽然针对CHK1激酶的有效抗癌药物正在临床上取得进展，但耐药性正在迅速出现。在这里，我们证明了CRISPR介导的鲜为人知的基因FAM122A的敲除赋予了细胞对CHK1抑制剂的抗性，并交叉耐受ATR抑制剂。FAM122A的敲除导致PP2A-B55α的激活，该磷酸酶使WEE1蛋白去磷酸化，并拯救WEE1免于泛素介导的降解。由此产生的WEE1蛋白表达增加减少了复制应激，激活了G2/M检查点，并赋予了细胞对CHK1抑制剂的抗性。有趣的是，在具有致癌基因驱动的复制应激的肿瘤细胞中，CHK1可以直接磷酸化FAM122A，导致PP2A-B55α磷酸酶激活和WEE1表达增加。CHK1抑制剂联合WEE1抑制剂可以克服这些肿瘤细胞的CHK1抑制剂耐药性，从而增强抗癌活性。肿瘤细胞中FAM122A的表达水平可作为预测CHK1抑制剂敏感性或耐药性的有用生物标志物。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 本研究旨在探究癌细胞对CHK1抑制剂产生耐药性的分子机制，并寻找预测耐药性的生物标志物。
- 核心机制
- CHK1直接磷酸化FAM122A的Ser37位点，导致FAM122A从PP2A-B55α复合物中释放并被14-3-3蛋白隔离在细胞质，从而激活PP2A-B55α，后者使WEE1去磷酸化并稳定WEE1蛋白，增强G2/M检查点，减少复制应激。FAM122A缺失模拟了这一激活过程，导致CHK1抑制剂耐药。
- 主要证据
- 通过CRISPR全基因组筛选发现FAM122A敲除赋予CHK1抑制剂耐药性，随后在多种细胞系中验证了FAM122A敲除或敲低对CHK1/ATR抑制剂敏感性的影响。通过Western blot、DNA纤维实验、彗星实验等检测复制应激和DNA损伤，通过免疫沉淀和激酶实验验证CHK1对FAM122A的磷酸化及其与PP2A、14-3-3的相互作用。
- 研究意义
- FAM122A表达水平可作为预测CHK1抑制剂敏感性的生物标志物，且CHK1抑制剂与WEE1抑制剂联合可克服耐药，为临床治疗策略提供依据。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证FAM122A敲除对CHK1和ATR抑制剂耐药性的影响
验证FAM122A敲除是否确实赋予CHK1和ATR抑制剂耐药性。
通过CRISPR敲除或siRNA敲低FAM122A，用细胞活力实验检测对CHK1抑制剂（prexasertib和SRA737）和ATR抑制剂（VE822）的敏感性。
检测FAM122A敲除对复制应激和DNA损伤的影响
探究FAM122A敲除是否减轻CHK1抑制剂诱导的复制应激和DNA损伤。
用Western blot检测pKAP1、pCHK1、γH2AX水平，用γH2AX焦点形成、DNA纤维实验、彗星实验检测DNA损伤和复制叉速度。
分析FAM122A敲除对WEE1蛋白稳定性的影响
确定FAM122A敲除是否通过影响WEE1蛋白降解来稳定WEE1。
用Western blot检测WEE1蛋白水平，用MG132和放线菌酮（CHX）实验分析蛋白降解。
验证PP2A-B55α在FAM122A调控WEE1稳定中的作用
验证FAM122A通过抑制PP2A-B55α来影响WEE1稳定性。
通过siRNA敲低PP2A各亚基，检测WEE1蛋白水平和细胞对prexasertib的敏感性。
验证CHK1对FAM122A的磷酸化及功能影响
证明CHK1磷酸化FAM122A的Ser37位点，并研究该磷酸化对FAM122A与PP2A结合及细胞功能的影响。
使用Phos-tag凝胶、体外激酶实验、免疫沉淀等方法验证CHK1磷酸化FAM122A，并检测野生型和S37A突变体与PP2A、14-3-3的结合差异及对prexasertib敏感性的影响。
评估FAM122A作为生物标志物及联合用药策略
探索FAM122A表达水平与CHK1抑制剂敏感性的关系，并验证CHK1抑制剂与WEE1抑制剂联合用药对耐药细胞的杀伤效果。
分析TCGA数据库和耐药细胞系中FAM122A表达，并在prexasertib耐药ES2细胞中恢复FAM122A表达或用AZD1775联合处理，检测细胞活力。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 药物处理 | Prexasertib | Eli Lilly & Co. | S7178 |
| SRA737 | Sierra Oncology | S8253 | |
| VE822 | Selleckchem | S7102 | |
| AZD1775 | Selleckchem | S1525 | |
| LB-100 | Selleckchem | S7537 | |
| DNA纤维实验 | 氯脱氧尿苷 | Sigma Aldrich | C6891 |
| 碘脱氧尿苷 | Sigma Aldrich | I7125 | |
| 细胞增殖检测 | 乙炔基脱氧尿苷 | ThermoFisher | E10415 |
| 细胞活力测定 | CellTiter-Glo发光细胞活力检测试剂盒 | Promega | G7570 |
| DNA提取 | DNeasy血液和组织试剂盒 | Qiagen | 69504 |
| EdU检测 | Click-iT EdU成像试剂盒（Alexa Fluor 488） | ThermoFisher | C10086 |
| 实时荧光定量PCR | PowerUp SYBR Green预混液 | Life Technologies | A25741 |
| 亚细胞分离 | 亚细胞分离试剂盒 | Cell Signaling Technology | 9038 |
| Western blot | FAM122A抗体 | Invitrogen | MA5-24510 |
| β-actin抗体 | Cell Signaling Technology | 4967S | |
| Vinculin抗体 | Cell Signaling Technology | 13901S | |
| KAP1抗体 | Abcam | ab22553 | |
| KAP1磷酸化S824抗体 | Abcam | ab84077 | |
| CHK1抗体 | Cell Signaling Technology | 2360S | |
| CHK1磷酸化S345抗体 | Cell Signaling Technology | 2348S | |
| WEE1抗体 | Cell Signaling Technology | 4936S | |
| WEE1磷酸化S53抗体 | Bioss | bs-5589R | |
| WEE1磷酸化S123抗体 | Bioss | BS-5218R | |
| CDK1抗体 | Abcam | ab18 | |
| CDK1磷酸化Y15抗体 | Cell Signaling Technology | 9111S | |
| PP2A-B55α抗体 | Sigma | SAB4300573 | |
| PP2A-B55α抗体 | Santa Cruz Biotechnology | SC-81606 | |
| HA标签抗体 | Cell Signaling Technology | 3724S | |
| Flag抗体 | Sigma | F3165 | |
| Flag抗体 | Sigma | F7425 | |
| GST抗体 | Cell Signaling Technology | 2625S | |
| 14-3-3抗体 | Cell Signaling Technology | 8312S | |
| GAPDH抗体 | Cell Signaling Technology | 5174S | |
| γ-H2AX抗体 | Cell Signaling Technology | 2577S | |
| 免疫荧光 | BrdU抗体 | Cell Signaling Technology | 5292S |
| BrdU抗体 | Abcam | ab6326 | |
| Western blot | Histone H3抗体 | Cell Signaling Technology | 9715S |
| 免疫荧光 | 山羊抗大鼠IgG（Alexa Fluor 488） | Invitrogen | A-11006 |
| 山羊抗小鼠IgG（Alexa Fluor 488） | Invitrogen | A32723 | |
| 鸡抗小鼠IgG（Alexa Fluor 594） | Invitrogen | A-21201 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| CRISPR筛选 | 细胞系A549和NCI-H460，Brunello sgRNA文库，MOI 0.3，pXPR_311 Cas9载体，筛选浓度（A549: 100nM，NCI-H460: 50nM），处理时间19天，polybrene浓度8 μg/ml，嘌呤霉素筛选2 μg/mL。 阅读提示：STAR Methods: Drug selection CRISPR screens |
| FAM122A敲除/敲低 | sgRNA靶向FAM122A序列（#1: GCAGATAAGCCACTCCTGGG， #2: CAGTGACACTTCGCCGGTGT），siRNA SMARTpool（Dharmacon, E-015499-00），转染试剂Lipofectamine RNAiMAX。 阅读提示：STAR Methods: CRISPR cas9 Knockout和siRNA transfection |
| 细胞活力测定 | 细胞密度1000-2000细胞/孔，处理时间4天，CellTiter-Glo试剂。 阅读提示：STAR Methods: CellTiter-Glo assay |
| 复制应激和DNA损伤检测 | Western blot检测pKAP1、pCHK1、γH2AX；γH2AX焦点形成；DNA纤维实验标记CIdU和IdU；彗星实验；prexasertib浓度和时间。 阅读提示：STAR Methods: Western blotting, Immunofluorescence, DNA fiber assay, Alkaline single-cell electrophoresis |
| WEE1稳定性实验 | MG132浓度和时间，放线菌酮（CHX）浓度和时间。 阅读提示：STAR Methods: 未单独列出，但图3B和3C提供了信息 |
| CHK1激酶实验 | CHK1蛋白（Millipore），ATP-γ-S浓度，反应条件（30°C, 30分钟）。 阅读提示：STAR Methods: Kinase Reactions |
| 耐药细胞系建立 | 逐步增加prexasertib浓度，处理时间2-3个月，最终维持浓度。 阅读提示：STAR Methods: Generation of Stable Cell Lines |