CD226表达分析
评估CD226在CD4+ T细胞亚群中的表达水平及其在EAE条件下的变化。
通过流式细胞术检测WT小鼠健康状态和EAE峰值时脾脏CD4+ T细胞、Tconv细胞和Tregs中CD226和TIGIT的表达。
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CD226通过Akt和Erk信号在EAE模型中减弱Tregs的增殖
CD226 Attenuates Treg Proliferation via Akt and Erk Signaling in an EAE Model.
实验完整度
高使用了CD226敲除小鼠EAE模型、体外iTreg分化与抑制实验、Western blot检测信号通路，涵盖体内外功能及机制验证。
主要模型
Cd226−/−小鼠EAE模型 WT小鼠EAE模型 体外诱导的iTreg细胞
重点核对
MOG35−55免疫剂量200μg，皮下注射 百白破毒素200ng腹腔注射（第0天和第2天） Tregs和iTregs的增殖检测（CFSE标记） Akt和Erk磷酸化水平的Western blot检测
摘要
分化簇226（CD226）分子在免疫应答过程中对效应性CD4+ T细胞的激活起关键作用，但CD226在CD4+ T亚群中的细胞内在功能尚不清楚。在本研究中，我们发现与野生型（WT）小鼠相比，Cd226−/−小鼠对髓鞘少突胶质细胞糖蛋白肽35-55（MOG35−55）诱导的实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）具有抗性，且IL-10+CD4+ T细胞高表达，IL-17A+CD4+ T细胞下调。在EAE期间，缺乏CD226时，Th17细胞向中枢神经系统（CNS）的浸润大幅减少。CD226缺陷促进了调节性T细胞（Tregs）的增殖，在EAE小鼠中观察到Tregs数量增加，并在体外支持诱导性调节性T细胞（iTregs）增殖的增强。Akt和Erk信号通路被证明参与Cd226−/− Tregs在体内外的增殖和功能。这些发现共同表明，CD226通过抑制Treg增殖，是调节Treg介导的自身免疫反应抑制的关键分子。因此，本研究结果确定了CD226在EAE中调节Treg功能的额外机制，并支持抗CD226分子对自身免疫性疾病的潜在治疗效果。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- CD226在CD4+ T细胞亚群（尤其是Tregs）中的细胞内在功能及其在EAE发病机制中的作用是什么？
- 核心机制
- CD226缺失通过激活Akt和Erk信号通路促进Treg增殖和IL-10产生，从而增强Treg介导的免疫抑制，抑制Th17细胞反应。
- 主要证据
- Cd226−/−小鼠对EAE抵抗性增强，脾脏和CNS中Tregs增加、Th17细胞减少；体外iTregs增殖和抑制活性增强；Western blot显示Cd226−/− Tregs中Akt和Erk磷酸化水平升高。
- 研究意义
- 研究揭示了CD226调控Treg功能的额外机制，支持靶向CD226分子在自身免疫性疾病中的潜在治疗应用。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
EAE模型诱导与评估
比较Cd226−/−和WT小鼠对MOG35−55诱导的EAE的易感性。
对小鼠进行MOG35−55免疫，监测临床评分、体重变化，并通过组织学染色评估脱髓鞘和炎症浸润。
CNS免疫细胞浸润分析
评估CD226缺失对EAE中CNS内免疫细胞浸润和Th17/Treg平衡的影响。
分离脊髓和脑单个核细胞，计数；通过免疫组化和免疫荧光检测IL-17A、RORγt和Foxp3的表达。
脾脏CD4+ T细胞亚群分析
比较Cd226−/−和WT小鼠脾脏中CD4+ T细胞亚群的数量和细胞因子产生。
通过流式细胞术和RT-qPCR检测脾脏CD4+ T细胞中IFN-γ、IL-4、IL-17A、IL-10及转录因子RORγt和Foxp3的表达。
Tregs增殖和抑制功能检测
研究CD226缺失对Tregs增殖和免疫抑制功能的影响。
新鲜分离或体外刺激的Tregs检测Ki67表达；体外抑制实验评估iTregs抑制CD4+ T细胞增殖的能力。
信号通路机制研究
探讨CD226缺失影响Tregs增殖和功能的分子机制。
通过Western blot检测Tregs和iTregs中Akt和Erk的磷酸化水平。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| EAE诱导 | MOG35-55肽 | Bankpeptide Biotec | GT10451-0614 |
| 完全弗氏佐剂 | Sigma | F-5881 | |
| 百日咳毒素 | Sigma | P2980 | |
| 细胞分离 | CD4+CD25+调节性T细胞分离试剂盒 | MACS Miltenyi Biotec | 130-091-041 |
| Mojosort™小鼠CD4 T细胞分离试剂盒 | Biolegend | 480006 | |
| Mojosort™小鼠CD4初始T细胞分离试剂盒 | Biolegend | 480039 | |
| 细胞培养 | RPMI 1640培养基 | -- | -- |
| 抗CD3抗体 | Biolegend | 100313 | |
| 抗CD28抗体 | Biolegend | 102111 | |
| 重组小鼠IL-2 | Peprotech | 212-12 | |
| iTreg极化 | 重组TGF-β1 | Peprotech | 100-21 |
| 增殖检测 | CFSE | Biolegend | 423801 |
| 组织学 | 固蓝 | -- | -- |
| 免疫荧光 | 抗Foxp3抗体 | Bioss | bsm-52079R |
| 抗RORγt抗体 | Bioss | bs-23110R | |
| Alexa Fluor 488标记的山羊抗兔二抗 | abcam | ab150081 | |
| 单个核细胞分离 | Percoll | GE Healthcare | 28-9038-34 |
| 流式细胞术 | 抗CD4抗体 | Biolegend | 100538 |
| 抗CD69抗体 | Biolegend | 104505 | |
| 抗CD25抗体 | Biolegend | 102007 | |
| 抗CD226抗体 | Biolegend | 125509 | |
| 抗TIGIT抗体 | Biolegend | 131510 | |
| 凋亡检测 | FITC Annexin V凋亡检测试剂盒（含PI） | Biolegend | 640914 |
| 流式细胞术 | 抗IFN-γ抗体 | Biolegend | 505807 |
| 抗IL-4抗体 | Biolegend | 504104 | |
| 抗IL-10抗体 | Biolegend | 505008 | |
| 抗IL-17A抗体 | Biolegend | 506904 | |
| 细胞刺激 | 细胞活化混合物（含布雷菲德菌素A） | Biolegend | 423303 |
| 流式细胞术 | 固定/破膜稀释液 | eBioscience | 00-5223 |
| 抗Foxp3抗体 | Biolegend | 320011 | |
| 抗Ki67抗体 | Biolegend | 652403 | |
| RT-qPCR | RNAiso Plus | TaKaRa | 9109 |
| PrimeScript RT Master Mix | TaKaRa | RRO36A | |
| SYBR PremixEx Taq™ II | TaKaRa | RR820A | |
| Western blot | RIPA裂解液 | Sigma | 70166 |
| Pierce BCA蛋白定量试剂盒 | Thermo | #23225 | |
| 抗Akt抗体 | Cell Signaling | #207 | |
| 抗磷酸化Akt抗体 | Cell Signaling | #207 | |
| 抗p44/42 MAPK抗体 | Cell Signaling | #5594 | |
| 抗磷酸化p44/42抗体 | Cell Signaling | #5595 | |
| 抗β-actin抗体 | Cell Signaling | #4970 | |
| 小鼠抗兔IgG单克隆抗体（HRP标记） | Cell Signaling | #93702 | |
| Tanon™ High-sig ECL Western blot底物试剂盒 | Tanon | 180-500 | |
| 显微镜 | Olympus显微镜 | Olympus Corporation | -- |
| Zeiss 710 LSM共聚焦显微镜 | Carl Zeiss Inc. | -- | |
| 统计分析 | GraphPad Prism 6 | Prism Software | -- |
| 流式数据分析 | FlowJo V10 | Tree Star | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| EAE诱导 | MOG35−55剂量200μg，皮下注射；完全弗氏佐剂含4mg热灭活结核菌株；百日咳毒素200ng腹腔注射第0天和第2天 阅读提示：Materials and Methods - Induction and Assessment of the EAE Model |
| 细胞培养 | CD4+ T细胞刺激条件：抗CD3 3μg/ml和抗CD28 5μg/ml，IL-2 2ng/ml 阅读提示：Materials and Methods - Cell Isolation and Culture |
| iTreg诱导 | 初始CD4+ T细胞分选纯度>95%；极化条件：抗CD3 3μg/ml，抗CD28 5μg/ml，TGF-β1 5ng/ml，培养3天 阅读提示：Materials and Methods - Cell Isolation and Culture |
| 增殖检测 | CFSE标记浓度2.5μM，标记8分钟；刺激条件：抗CD3 5μg/ml和抗CD28 5μg/ml，培养3天 阅读提示：Materials and Methods - CFSE Labeling and iTreg Inhibition Assay |
| 信号通路检测 | Tregs刺激条件：抗CD3 5μg/ml，抗CD28 5μg/ml，IL-2 2ng/ml，2小时；Western blot检测p-Akt和p-Erk 阅读提示：Results - Akt and Erk Signaling Pathways ...; Materials and Methods - Western Blotting |