临床样本相关性分析
评估TTN和lncRNA-TTN-AS1在SKCM患者组织中的表达及其与预后的关系
使用TCGA数据库分析TTN表达，对198例SKCM组织进行TTN原位杂交，对165例组织进行lncRNA-TTN-AS1原位杂交，并分为高表达和低表达组，进行Kaplan-Meier生存分析。
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长链非编码RNA TTN-AS1通过维持皮肤皮肤黑色素瘤中TTN的表达促进肿瘤发生和转移
Long noncoding RNA TTN-AS1 facilitates tumorigenesis and metastasis by maintaining TTN expression in skin cutaneous melanoma.
实验完整度
高包含体外细胞功能实验、体内小鼠移植瘤和转移模型、临床样本生存分析，以及启动子活性、mRNA稳定性等机制验证，证据层级完整。
主要模型
B16F10小鼠黑色素瘤细胞 C57BL/6小鼠移植瘤模型 C57BL/6小鼠尾静脉转移模型 198例及165例SKCM患者组织样本
重点核对
B16F10细胞中lncRNA-TTN-AS1和TTN的敲低与过表达效率 皮下注射1×10^7 B16F10细胞于C57BL/6小鼠的肿瘤生长评估 尾静脉注射1×10^6 GFP标记B16F10细胞的转移评估 α-amanitin（50 μg/mL）处理后的TTN mRNA半衰期测定 TTN启动子荧光素酶报告基因实验
摘要
反义转录本，从蛋白编码或正义链的相对链转录而来，已被报道在基因调控中发挥关键作用。反义RNA的干扰可以改变正义信使RNA的表达。在本研究中，一种长链非编码RNA TTN-AS1（lncRNA-TTN-AS1），其转录方向与人类肌联蛋白（TTN）基因相反，已在皮肤皮肤黑色素瘤（SKCM）中被鉴定和探索。我们发现TTN和lncRNA-TTN-AS1的表达在SKCM细胞中显著正相关。功能上，TTN和lncRNA-TTN-AS1的异位表达在体外和体内均促进了SKCM的肿瘤发生和转移。此外，敲低TTN部分消除了lncRNA-TTN-AS1诱导的SKCM肿瘤发生。机制上，转录起始位点的低甲基化是lncRNA-TTN-AS1高表达的原因。LncRNA-TTN-AS1通过在转录和转录后水平促进TTN表达来促进SKCM进展。具体来说，lncRNA-TTN-AS1对TTN启动子活性的增加有显著作用。此外，lncRNA-TTN-AS1还通过增加TTN mRNA的稳定性诱导TTN在细胞质中的积累。临床上，我们发现高TTN和lncRNA-TTN-AS1表达与SKCM患者较差的总生存期正相关，并可能被认为是SKCM患者的新型生物标志物和药物靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- lncRNA-TTN-AS1在皮肤黑色素瘤中是否通过调控TTN表达影响肿瘤发生和转移？
- 核心机制
- lncRNA-TTN-AS1通过转录起始位点低甲基化高表达，在转录水平激活TTN启动子活性，并在转录后水平增加TTN mRNA稳定性，从而上调TTN表达，促进SKCM进展。
- 主要证据
- 体外qRT-PCR和western blot证实lncRNA-TTN-AS1敲低/过表达改变TTN mRNA和蛋白水平；双荧光素酶报告基因显示lncRNA-TTN-AS1增强TTN启动子活性；RNA稳定性实验显示lncRNA-TTN-AS1延长TTN mRNA半衰期；体内移植瘤和转移模型验证功能。
- 研究意义
- 首次证明TTN/lncRNA-TTN-AS1在SKCM中的协同调控，为阐明SKCM发病机制及开发靶向诊断和治疗方法提供依据，TTN和lncRNA-TTN-AS1组合可能作为SKCM患者的预后生物标志物组合。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
细胞系中表达相关性及调控验证
验证lncRNA-TTN-AS1是否调控TTN表达
在7种SKCM细胞系中检测lncRNA-TTN-AS1和TTN表达，用shRNA敲低和过表达lncRNA-TTN-AS1，通过qRT-PCR和western blot检测TTN表达。
体外功能实验
探究TTN和lncRNA-TTN-AS1对SKCM细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响
在B16F10细胞中敲低或过表达TTN和lncRNA-TTN-AS1，进行集落形成、CCK-8、流式细胞术、伤口愈合、transwell迁移和侵袭实验，并检测细胞周期和凋亡相关蛋白。
体内肿瘤生长和转移实验
验证TTN和lncRNA-TTN-AS1在体内对SKCM肿瘤生长和转移的作用
将敲低或过表达lncRNA-TTN-AS1的B16F10细胞皮下注射或尾静脉注射C57BL/6小鼠，监测肿瘤生长和转移，并进行免疫组化检测Ki-67和TTN。
机制验证：DNA甲基化
探究lncRNA-TTN-AS1高表达的机制
通过计算机预测CpG岛，并用MS-PCR检测不同细胞系中lncRNA-TTN-AS1的甲基化状态及其相对表达。
机制验证：转录水平调控
验证lncRNA-TTN-AS1是否通过激活TTN启动子活性调控TTN表达
构建TTN启动子（2000bp）荧光素酶报告质粒，转染293T细胞，过表达lncRNA-TTN-AS1后检测双荧光素酶活性。
机制验证：转录后水平调控
验证lncRNA-TTN-AS1是否通过增加TTN mRNA稳定性增强TTN表达
在B16F10细胞中过表达或敲低lncRNA-TTN-AS1，用α-amanitin阻断新RNA合成，测定TTN mRNA半衰期；并通过免疫荧光和核质分离检测TTN蛋白和mRNA的分布。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI1640培养基 | Invitrogen | -- |
| 胎牛血清 | Life Technologies | -- | |
| Effectene转染试剂 | Qiagen | -- | |
| 嘌呤霉素 | Sangon Biotech | -- | |
| RNA提取和qRT-PCR | TRIzol试剂 | Invitrogen | -- |
| PrimeScript逆转录试剂盒 | Takara | -- | |
| PowerUp SYBR Green预混液 | Invitrogen | -- | |
| 亚细胞定位分析 | DAPI染色液 | Sigma-Aldrich | -- |
| PARIS试剂盒（核质分离） | Ambion | -- | |
| RNA pull-down和质谱 | 生物素RNA标记混合物 | Roche | -- |
| T7 RNA聚合酶 | Roche | -- | |
| 无RNase的DNase I | Roche | -- | |
| RNeasy小型RNA提取试剂盒 | Qiagen | -- | |
| 链霉亲和素琼脂糖珠 | Invitrogen | -- | |
| Pierce磁性RNA-蛋白下拉试剂盒 | Invitrogen | -- | |
| OrbitrapVelos Pro液相色谱-质谱系统 | Thermo Scientific | -- | |
| 流式细胞术 | Annexin V-APC凋亡检测试剂盒 | BD Biosciences | -- |
| 细胞周期检测试剂盒 | BD Biosciences | -- | |
| 流式细胞仪 | Beckman Coulter | -- | |
| 免疫荧光 | 小鼠抗TTN抗体 | Millipore | -- |
| Cy3标记二抗 | Servicebio | -- | |
| 磷酸盐缓冲液 | HyClone | -- | |
| DAPI染色液 | Sigma-Aldrich | -- | |
| AiryScan LSM800共聚焦显微镜 | Carl Zeiss | -- | |
| 体内成像 | IVIS Lumina III活体成像系统 | PerkinElmer | -- |
| 细胞活力实验 | CCK8试剂盒 | Abmole | -- |
| 甲基化分析 | QiAmp DNA血液迷你提取试剂盒 | Qiagen | -- |
| EZ DNA甲基化Gold试剂盒 | Zymo | -- | |
| TTN启动子活性分析 | pGL3-Basic载体 | Hanbio biotechnology | -- |
| pRL-TK载体 | Hanbio biotechnology | -- | |
| RNA稳定性分析 | α-鹅膏蕈碱 | Millipore | -- |
| Western blotting | RIPA裂解液 | Roche | -- |
| PVDF膜 | Millipore | -- | |
| BeyoECL Plus化学发光液 | Beyotime | -- | |
| 抗Cyclin D1抗体 | Wanleibio | WL01435a | |
| 抗CDK2抗体 | Wanleibio | WL01543 | |
| 抗CDK4抗体 | Wanleibio | WL01711 | |
| 抗Bax抗体 | Wanleibio | WL01637 | |
| 抗pro-caspase 3抗体 | Wanleibio | WL02117 | |
| 抗cleaved-caspase 3抗体 | Wanleibio | WL02117 | |
| 抗pro-caspase 9抗体 | Wanleibio | WL03421 | |
| 抗cleaved-caspase 9抗体 | Wanleibio | WL03421 | |
| 抗Titin/CMD1G抗体 | Bioss | bs-9861R | |
| 抗β-actin抗体 | Liankebio | 70-ab36861-050 | |
| 辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG | Liankebio | 70-GAR007 | |
| 统计分析 | GraphPad Prism 6软件 | GraphPad Software | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养与转染 | 细胞系来源、培养基、转染试剂和质粒载体 阅读提示：Materials and methods 中的 Cell culture and transfection |
| 体外功能实验 | B16F10细胞中shRNA和过表达载体的转染效率 阅读提示：Results 中图2和图3的图注 |
| 体内动物实验 | 小鼠品系、周龄、性别、细胞注射数量和部位，以及实验分组 阅读提示：Materials and methods 中的 Animal studies |
| 机制验证 | 启动子报告基因实验的细胞系（293T）、α-amanitin浓度和作用时间 阅读提示：Materials and methods 中的 Analysis of TTN promoter activity 和 RNA stability assay |
| 统计与生存分析 | 患者样本量、分组依据，以及统计检验方法 阅读提示：Materials and methods 中的 Statistical analysis 和 Figure 1 图注 |