检测circTTBK2在胶质瘤组织和细胞中的表达及临床相关性
明确circTTBK2在胶质瘤中的表达水平及其与患者预后的关系。
收集胶质瘤组织和正常脑组织，培养胶质瘤细胞系和正常星形胶质细胞，通过qRT-PCR检测circTTBK2表达，并进行Kaplan-Meier生存分析。
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CircTTBK2通过调控miR-145-5p/CPEB4轴促进胶质瘤进展
CircTTBK2 Contributes to the Progression of Glioma Through Regulating miR-145-5p/CPEB4 Axis.
实验完整度
高包含体外细胞功能实验（增殖、凋亡、迁移、侵袭、糖酵解）、机制验证（双荧光素酶、RIP）、体内裸鼠异种移植实验及临床组织样本分析，多个独立证据层级。
主要模型
胶质瘤细胞系T98G 胶质瘤细胞系LN229 正常人星形胶质细胞NHA BALB/c裸鼠异种移植模型 胶质瘤患者组织标本
重点核对
si-circTTBK2敲低效率验证 miR-145-5p抑制剂转染效率验证 CPEB4敲低效率验证 体内实验中sh-circTTBK2慢病毒转染及肿瘤体积测量
摘要
背景：目前，环状RNA（circRNAs）已被证实在包括胶质瘤在内的恶性肿瘤中发挥重要作用。然而，circTTBK2在胶质瘤中的功能在很大程度上尚不清楚。材料与方法：采用实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）检测circTTBK2、TTBK2 mRNA、miR-145-5p和细胞质多聚腺苷酸化元件结合蛋白4（CPEB4）mRNA的表达水平。利用放线菌素D和RNase R消化实验检测circTTBK2的特性。分别采用3-(4,5-二甲基-2-噻唑基)-2,5-二苯基-2-H-溴化四氮唑（MTT）法、流式细胞术和Transwell实验检测细胞增殖、凋亡和转移。用特异性试剂盒评估糖酵解水平。采用Western blot检测己糖激酶2（HK2）和CPEB4的蛋白水平。通过双荧光素酶报告基因和RNA免疫沉淀（RIP）实验验证miR-145-5p与circTTBK2或CPEB4之间的靶向关系。采用小鼠异种移植实验研究circTTBK2在体内肿瘤发生中的作用。结果：CircTTBK2在胶质瘤组织和细胞中表达上调，其水平与胶质瘤患者的不良生存相关。敲低circTTBK2可抑制胶质瘤细胞增殖、迁移、侵袭和糖酵解，促进细胞凋亡，并在体内抑制肿瘤生长。CircTTBK2作为miR-145-5p的海绵，抑制miR-145-5p可恢复circTTBK2敲低对胶质瘤细胞恶性行为的影响。此外，CPEB4是miR-145-5p的直接靶基因，抑制miR-145-5p通过靶向CPEB4促进胶质瘤细胞进展。结论：CircTTBK2通过调节miR-145-5p/CPEB4轴在胶质瘤中发挥肿瘤启动子的作用，这可能为胶质瘤治疗提供新的视角。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- circTTBK2在胶质瘤中的表达、功能及潜在分子机制尚不清楚，本研究旨在探讨circTTBK2在胶质瘤进展中的作用及调控机制。
- 核心机制
- circTTBK2作为miR-145-5p的海绵，负调控miR-145-5p表达，从而解除其对CPEB4的抑制作用，最终促进胶质瘤细胞的恶性行为。
- 主要证据
- qRT-PCR显示circTTBK2和CPEB4在胶质瘤组织和细胞中高表达，miR-145-5p低表达；敲低circTTBK2抑制细胞增殖、迁移、侵袭和糖酵解，促进凋亡，并抑制体内肿瘤生长；双荧光素酶和RIP实验证实circTTBK2直接靶向miR-145-5p，miR-145-5p直接靶向CPEB4；恢复实验证明circTTBK2通过miR-145-5p/CPEB4轴发挥作用。
- 研究意义
- 本研究首次揭示circTTBK2/miR-145-5p/CPEB4调控网络，加深了对胶质瘤发病机制的认识，可能为胶质瘤提供新的诊断生物标志物和治疗策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证circTTBK2的环状结构特征
确认circTTBK2具有环状RNA的稳定性特征。
使用放线菌素D处理T98G细胞检测circTTBK2半衰期，使用RNase R消化RNA后检测circTTBK2和TTBK2 mRNA的水平。
敲低circTTBK2观察体外细胞功能变化
评估circTTBK2对胶质瘤细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭和糖酵解的影响。
用si-circTTBK2转染T98G和LN229细胞，通过MTT、流式细胞术、Transwell实验和糖酵解检测试剂盒评估细胞功能，Western blot检测HK2蛋白。
验证circTTBK2对miR-145-5p的靶向调控
证实circTTBK2直接靶向并负调控miR-145-5p。
通过双荧光素酶报告基因和RIP实验验证circTTBK2与miR-145-5p的结合，过表达和敲低circTTBK2检测miR-145-5p表达变化。
验证CPEB4是miR-145-5p的直接靶基因
确认miR-145-5p直接靶向CPEB4并负调控其表达。
通过双荧光素酶报告基因和RIP实验验证miR-145-5p与CPEB4的结合，调控miR-145-5p表达后检测CPEB4 mRNA和蛋白水平。
恢复实验验证circTTBK2/miR-145-5p/CPEB4轴
证实circTTBK2通过miR-145-5p/CPEB4轴调控胶质瘤细胞恶性行为。
在敲低circTTBK2的同时抑制miR-145-5p或敲低CPEB4，观察细胞功能变化，检测CPEB4表达。
体内裸鼠异种移植实验
验证circTTBK2敲低对体内肿瘤生长的影响。
将稳定敲低circTTBK2的T98G细胞皮下接种BALB/c裸鼠，定期测量肿瘤体积，4周后称重并检测肿瘤组织中相关分子表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
验证细胞功能变化
验证分子表达变化
验证机制链路
评估体内效果
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Solarbio | -- |
| 胎牛血清 | Solarbio | -- | |
| 青霉素-链霉素 | Solarbio | -- | |
| RNA提取 | RNAiso Plus | Takara | -- |
| 逆转录 | AMV逆转录酶 | Promega | -- |
| TaqMan MicroRNA逆转录试剂盒 | Applied Biosystems | -- | |
| qRT-PCR | ABI 7500 PCR系统 | Applied Biosystems | -- |
| AceQ通用SYBR qPCR预混液 | Vazyme | -- | |
| 引物 | Sangon | -- | |
| RNase R消化 | RNase R | Epicentre | -- |
| 细胞转染 | Lipofectamine 2000 | Invitrogen | -- |
| MTT实验 | MTT | Sigma-Aldrich | -- |
| 二甲基亚砜 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 酶标仪 | Potenov | -- | |
| 流式细胞术 | Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒 | Vazyme | -- |
| FACScan流式细胞仪 | Beckman Coulter | -- | |
| Transwell实验 | Transwell小室 | BD Bioscience | -- |
| 基质胶 | BD Biosciences | -- | |
| 结晶紫 | Solarbio | -- | |
| 糖酵解检测 | 葡萄糖检测试剂盒 | Sigma-Aldrich | -- |
| 乳酸检测试剂盒 | Sigma-Aldrich | -- | |
| Western blot | RIPA裂解液 | CWBio | -- |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Vazyme | -- | |
| SDS-PAGE凝胶 | Solarbio | -- | |
| PVDF膜 | Millipore | -- | |
| 抗HK2抗体 | Bioss | bs-9455R | |
| 抗CPEB4抗体 | Bioss | bs-14020R | |
| 抗β-actin抗体 | Bioss | bs-0061R | |
| HRP标记二抗 | Bioss | bs-0295M-HRP | |
| ECL化学发光试剂盒 | Beyotime | -- | |
| 双荧光素酶报告基因 | 双荧光素酶报告基因检测系统 | Promega | -- |
| RIP | Magna RNA结合蛋白免疫沉淀试剂盒 | Millipore | -- |
| 抗IgG抗体 | Abcam | -- | |
| 抗Ago2抗体 | Abcam | -- | |
| 体内实验 | BALB/c裸鼠 | Vital River Laboratory | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 组织样本采集 | 胶质瘤组织和正常脑组织的来源、数量（40例胶质瘤，40例正常），以及伦理审批号（No.2019TJ881）。 阅读提示：Materials and Methods - Tissues Acquisition |
| 细胞培养 | 细胞系（T98G、LN229、NHA）的来源，培养基DMEM、10% FBS、1%青霉素-链霉素，培养条件（37°C，5% CO2）。 阅读提示：Materials and Methods - Cell Culture |
| qRT-PCR | RNA提取试剂（RNAiso Plus）、逆转录酶、qRT-PCR试剂和引物序列、内参（β-actin/U6）、2^-ΔΔCt方法。 阅读提示：Materials and Methods - Quantitative Real-Time Polymerase Chain Reaction |
| 环状RNA稳定性实验 | 放线菌素D浓度（2 μg/mL）和处理时间点，RNase R处理条件（1 μg RNA、2 U、37°C、20 min）。 阅读提示：Materials and Methods - Actinomycin D and RNase R Digestion Assays |
| 细胞转染 | 转染试剂（Lipofectamine 2000）和siRNA/质粒序列（GenePharma设计），转染效率验证。 阅读提示：Materials and Methods - Cell Transfection |
| MTT实验 | 细胞接种密度（2×10^4 cells/well）、MTT浓度和孵育时间、DMSO溶解、490 nm检测。 阅读提示：Materials and Methods - MTT Assay |
| 流式细胞术 | Annexin V-FITC和PI用量（各5 μL）、孵育时间（15 min）、流式细胞仪型号。 阅读提示：Materials and Methods - Flow Cytometry Analysis |
| Transwell实验 | 细胞数（1×10^4 cells）、基质胶包被（侵染）或不包被（迁移）、孵育时间（24 h）、结晶紫染色。 阅读提示：Materials and Methods - Transwell Assay |
| Western blot | 蛋白提取试剂（RIPA）、BCA定量、SDS-PAGE和PVDF膜、一抗和二抗的稀释比例（文中未明确说明）、ECL显影。 阅读提示：Materials and Methods - Western Blot Assay |
| 双荧光素酶报告基因 | 报告质粒构建（WT/MUT-circTTBK2、WT/MUT-CPEB4）、共转染miR-145-5p mimic或miR-NC mimic、检测时间（48 h）。 阅读提示：Materials and Methods - Dual-Luciferase Reporter Assay |
| RIP实验 | RIP试剂盒（Magna）、抗体（Ago2和IgG）、qRT-PCR检测。 阅读提示：Materials and Methods - RNA Immunoprecipitation Assay |
| 体内异种移植 | 动物品系（BALB/c裸鼠）、周龄（4-6周）、细胞接种数量（文中未明确说明）、肿瘤体积测量时间和公式、4周后检测。 阅读提示：Materials and Methods - Murine Xenograft Model |