验证TG促进PDX1表达
检测TG能否上调胰岛β细胞中PDX1的表达。
使用RT-qPCR检测PDX1 mRNA水平，Western blot检测PDX1蛋白水平；并用PDX1启动子荧光素酶报告基因检测启动子活性；原代胰岛分离后处理验证。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
鸢尾素提高PDX1表达并通过激活ERK和减轻内质网应激保护胰岛β细胞
Tectorigenin enhances PDX1 expression and protects pancreatic β-cells by activating ERK and reducing ER stress.
实验完整度
高包含体外细胞实验（INS-1、RIN-m5F）、原代胰岛、动物模型（HFHSD小鼠）以及分子机制验证（ERK通路、凋亡与ER应激），证据层级多样且包含功能与机制验证。
主要模型
INS-1细胞系 RIN-m5F细胞系 小鼠原代胰岛 高脂高蔗糖饮食（HFHSD）诱导的C57BL/6J小鼠模型
重点核对
TG处理浓度：40 μg/ml ERK抑制剂U0126浓度：10 μm 脂毒性模型：200 μm棕榈酸（PA）处理24小时 糖毒性模型：33 mM葡萄糖处理72小时 动物实验分组：预防组和治疗组，TG剂量为10、20、40 mg/kg腹腔注射
摘要
胰腺/十二指肠同源盒蛋白1（PDX1）是调节胰岛β细胞增殖、分化和功能的重要转录因子。PDX1表达减少被认为有助于糖尿病中β细胞的丢失和功能障碍。因此，促进PDX1表达可能是保留β细胞质量和功能的有效策略。此前，我们建立了PDX1启动子依赖性荧光素酶系统，以筛选能够促进PDX1表达的化合物。天然化合物鸢尾素（TG）被确定为能够增强PDX1基因启动子活性的有希望的候选物。在本研究中，我们首先证明TG可以通过激活细胞外信号相关激酶（ERK）来促进β细胞中PDX1的表达，如ERK磷酸化增加所示；这种效应在正常或高糖/高脂毒性条件下均可观察到。然后我们发现，TG可以通过激活ERK、减少活性氧和内质网（ER）应激，抑制诱导的凋亡并提高β细胞在高糖毒性和脂毒性下的存活率。这些效应在体内同样成立：预防性或治疗性使用TG可明显抑制高脂/高蔗糖饮食（HFHSD）小鼠胰腺中的ER应激并减少胰岛β细胞凋亡，从而分别显著维持或恢复β细胞质量和胰岛大小。因此，TG的预防性和治疗性使用均改善了HFHSD损伤的小鼠葡萄糖代谢，表现为高血糖和葡萄糖耐受不良的改善。总之，TG作为一种促进PDX1表达的化合物，在体外和体内均对胰岛β细胞表现出强大的保护作用。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- TG是否能够促进胰岛β细胞中PDX1表达并保护β细胞免受糖脂毒性损伤，其分子机制是什么？
- 核心机制
- TG通过激活ERK信号通路，上调PDX1表达，并降低活性氧水平和内质网应激，从而抑制β细胞凋亡并改善其功能。
- 主要证据
- 体外：INS-1和RIN-m5F细胞及小鼠原代胰岛中，TG促进PDX1表达并改善胰岛素分泌，且被U0126阻断；体内：HFHSD小鼠预防和治疗性给予TG显著抑制ER应激、减少β细胞凋亡，恢复β细胞质量和胰岛大小，改善糖耐量。
- 研究意义
- TG作为一种促进PDX1表达的天然化合物，具有保护胰岛β细胞的潜力，可能作为预防或治疗糖尿病的候选药物。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证TG通过ERK信号通路促进PDX1表达
探究TG上调PDX1表达是否依赖于ERK信号通路的激活。
Western blot检测ERK磷酸化水平，使用ERK抑制剂U0126处理，观察PDX1表达和荧光素酶活性的变化。
评估TG对β细胞功能的影响
检测TG对胰岛β细胞胰岛素分泌功能的影响。
使用分离的小鼠胰岛进行灌流分泌实验，检测TG即时或24小时处理后的胰岛素分泌水平。
验证TG对糖脂毒性诱导凋亡的保护作用及其机制
探究TG能否保护β细胞免受棕榈酸和高糖诱导的凋亡，并验证ERK通路参与。
建立脂毒性（200 μm PA）和糖毒性（33 mM Glu）模型，MTT检测细胞活力，流式细胞术检测凋亡，Western blot检测凋亡相关蛋白（CC3）和PDX1、ERK磷酸化水平，并用U0126验证ERK介导的作用。
验证TG对氧化应激和内质网应激的抑制作用
探究TG是否通过降低ROS和减轻ER应激来保护β细胞。
使用DCFH-DA探针检测ROS水平；Western blot检测ER应激相关蛋白（P-PERK、CHOP、caspase-12、Bcl2），RT-qPCR检测ATF4 mRNA水平。
验证TG在体内的预防和治疗效果
评估TG对HFHSD诱导的糖尿病小鼠的血糖代谢和胰岛保护作用。
采用HFHSD喂养C57BL/6J小鼠建立T2DM模型，预防组在喂养1个月后给予TG，治疗组在喂养4个月后给予TG，分别检测体重、空腹血糖、血清胰岛素、HOMA-β、IPGTT，并进行胰腺组织学分析（H&E、胰岛素IHC、CC3和CHOP检测）。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 药物处理 | 鸢尾素 | Chengdu Biopurify Phytochemicals Ltd. | -- |
| 糖毒性模型 | D-(+)-葡萄糖 | Sigma-Aldrich | G7021 |
| 脂毒性模型 | 棕榈酸 | Sigma-Aldrich | P5585 |
| 细胞培养 | RPMI 1640培养基 | Sigma-Aldrich | R8758 |
| 胎牛血清 | GIBCO | -- | |
| DMEM培养基 | GIBCO | -- | |
| 硫酸庆大霉素 | Huangzhong Pharmaceutical Co., Ltd. | -- | |
| 细胞活性检测 | MTT试剂 | Beyotime | -- |
| Western blot | 增强化学发光试剂 | Beyotime | -- |
| 报告基因检测 | pGL3-PDX1-luc报告质粒 | -- | -- |
| Western blot | 抗PDX1抗体 | Proteintech | 20989-1-AP |
| 抗GAPDH抗体 | Proteintech | 60004-1-Ig | |
| 抗PERK抗体 | Proteintech | 20582-1-AP | |
| 抗CHOP抗体 | Proteintech | 15204-1-AP | |
| 免疫组化 | 抗胰岛素抗体 | Proteintech | 15848-1-AP |
| Western blot | 抗ERK抗体 | Cell Signaling Technology | 4695 |
| 抗磷酸化ERK抗体 | Cell Signaling Technology | 4370S | |
| 抗Caspase-3抗体 | Cell Signaling Technology | 9662 | |
| 抗剪切Caspase-3抗体 | Cell Signaling Technology | 9661 | |
| 抗磷酸化PERK抗体 | Cell Signaling Technology | 3179 | |
| 抗Caspase-12抗体 | Cell Signaling Technology | 2202 | |
| 抗Bcl2抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-7382 | |
| 细胞转染 | 磷酸钙细胞转染试剂盒 | Beyotime | -- |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Invitrogen | -- |
| RT-qPCR | 实时PCR试剂盒 | TransGen Biotech | -- |
| 2× FastStart Universal SYBR Green Master (Rox) | Roche Diagnostics | -- | |
| 胰岛分离 | 胶原酶A | Roche Diagnostics | 11088793001 |
| 体视显微镜(Szx7) | Olympus Corp. | -- | |
| 胰岛素分泌检测 | 胰岛素ELISA试剂盒 | Enzyme-linked Biotechnology | -- |
| 凋亡检测 | Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒 | BD Biosciences | -- |
| ROS检测 | DCFH-DA荧光探针 | Beyotime | S0033 |
| 动物实验 | 正常饮食 | Beijing Keao Xieli Feed Co., Ltd. | -- |
| 高脂高蔗糖饮食 | Mediscience Ltd. | MD 45% fat | |
| 生化分析 | 血糖仪 | -- | -- |
| 小鼠胰岛素ELISA试剂盒 | Enzyme-linked Biotechnology | -- | |
| 组织病理 | 组化链霉亲和素-过氧化物酶试剂盒 | Bioss | sp-0023 |
| DAB显色试剂盒 | Bioss | C02-04001 | |
| 图像分析 | Image-Pro Plus 5.0软件 | Media Cybernetics | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | INS-1和RIN-m5F细胞培养基成分（含50 μm β-巯基乙醇、10% FBS、200单位/ml庆大霉素），以及HEK293T细胞培养条件。 阅读提示：Experimental Procedures: Cell culture |
| TG处理 | TG浓度40 μg/ml，处理时间（3、9、24小时等），以及制备溶剂是否含DMSO。 阅读提示：Figure 1 legend及Results中描述 |
| ERK通路抑制 | U0126浓度10 μm，以及是否与TG同时处理。 阅读提示：Figure 1和图2图注及相应Results |
| 脂毒性模型 | 棕榈酸（PA）浓度200 μm，处理24小时，以及BSA结合方式（未明确说明）。 阅读提示：Figure 2 legend及Results部分 |
| 糖毒性模型 | 葡萄糖浓度33 mm，处理72小时。 阅读提示：Figure 2 legend及Results部分 |
| 动物实验 | 小鼠品系、年龄、性别（C57BL/6J，4周龄，雄性），HFHSD配方（45%脂肪，20%蔗糖），TG剂量（10、20、40 mg/kg）腹腔注射，频率（每两天一次），预防组和治疗组给药时间点。 阅读提示：Experimental Procedures: Animals and treatments |
| IPGTT | 空腹时长（8小时），葡萄糖剂量（1 g/kg体重），血糖测定时间点（0, 15, 30, 45, 60, 90分钟）。 阅读提示：Experimental Procedures: IPGTT |
| 组织学分析 | 胰腺固定、包埋、切片厚度（5 μm），抗体稀释度（胰岛素1:200，CC3 1:100），MOD定量方法，β细胞质量计算公式。 阅读提示：Experimental Procedures: Histopathology |