H19表达特征分析
检测H19在不同组织和PSC分化过程中的表达模式及其细胞定位。
通过qRT-PCR检测H19在猪不同组织（心肌、肺、胃、骨骼肌等）中的表达；在PSC增殖和分化不同时间点检测H19表达；通过细胞核质分离和RNA FISH确定H19亚细胞定位。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
长链非编码RNA H19通过miR-140-5p/SOX4和DBN1调控猪卫星细胞分化
Long Non-coding RNA H19 Regulates Porcine Satellite Cell Differentiation Through miR-140-5p/SOX4 and DBN1.
实验完整度
高包含体外细胞模型（猪卫星细胞）的功能实验（siRNA敲低、过表达）、转录组测序、双荧光素酶报告、RNA pull-down、RIP、ChIP等机制验证，实验层级丰富。
主要模型
猪骨骼肌卫星细胞（PSCs） PK15细胞系 3日龄约克夏公猪
重点核对
H19敲低效率最高的是siH19-3，使用浓度为50 nM 分化诱导使用含5%马血清的DMEM，24 h和36 h收获细胞 miR-140-5p mimic和inhibitor序列及使用浓度 SOX4 ASO序列（GTACTTGTAGTCGGGGTAGT） ChIP实验使用107细胞和10 μg MYOD抗体
摘要
H19基因在小鼠中促进骨骼肌分化，但在猪中H19调控肌生成的调控模型和机制尚不清楚。因此，需要确定H19在猪骨骼肌卫星细胞（PSCs）分化中的调控模式。我们观察到，敲低H19基因可降低PSCs中肌细胞生成素（MYOG）基因、生肌决定因子（MYOD）和肌球蛋白重链（MYHC）的表达。因此，我们在敲低H19后两个分化时间点构建并测序了12个PSCs cDNA文库，以分析转录组差异。共鉴定出11,419个差异表达基因（DEGs）。在这些DEGs中，通过生物信息学分析和蛋白质相互作用实验，我们发现SRY盒转录因子4（SOX4）和 Drebrin 1（DBN1）是H19调控PSC分化的关键基因。功能分析表明，SOX4和DBN1促进PSC分化。机制上，H19通过两种不同的途径调控PSC分化。一方面，H19作为miR-140-5p的分子海绵，miR-140-5p抑制PSCs分化，从而调节SOX4的去抑制。另一方面，H19通过直接与DBN1结合来调控PSC分化。此外，MYOD结合到H19和DBN1的启动子上。敲低MYOD抑制H19和DBN1的表达。我们确定了H19的功能，并提供了一个分子模型来阐明H19在调控PSC分化中的作用。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- H19在猪骨骼肌卫星细胞分化中的调控模式和分子机制是什么？
- 核心机制
- H19通过两种途径调控PSC分化：一是作为miR-140-5p分子海绵，解除miR-140-5p对SOX4的抑制；二是直接结合蛋白DBN1。MYOD结合H19和DBN1启动子并调节其表达。
- 主要证据
- 转录组测序（12个文库，11,419个DEGs）、siRNA敲低和过表达实验、双荧光素酶报告、RNA pull-down和RIP验证直接结合，ChIP-qPCR验证MYOD结合。
- 研究意义
- 首次报道猪肌生成中H19敲低介导的DEGs，揭示H19调控PSC分化的机制，为猪肌生成提供分子基础。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
H19敲低功能实验
验证H19在PSC分化中的功能。
设计3个siRNA敲低H19，筛选效率最高的siH19-3，检测分化标志基因MYOG、MYOD、MYHC的mRNA和蛋白水平，并通过MYHC免疫荧光观察肌管形成。
转录组测序和DEGs分析
系统性鉴定H19敲低后PSC分化的差异表达基因和富集通路。
构建12个cDNA文库（si24h, NC24h, si36h, NC36h，每个组3个重复），Illumina HiSeq测序，鉴定DEGs并进行GO和KEGG富集分析，构建表达调控网络。
候选基因SOX4功能研究
验证SOX4在PSC分化中的作用及其受H19调控。
检测SOX4在H19敲低后的表达变化；用ASO敲低和过表达SOX4，检测分化标志基因表达和肌管形成。
H19作为miR-140-5p分子海绵验证
验证H19通过海绵吸附miR-140-5p调控SOX4表达。
生物信息学预测结合位点；双荧光素酶报告基因验证miR-140-5p与H19和SOX4 3'UTR结合；miR-140-5p mimic/inhibitor转染观察对SOX4和分化标志物的影响；拯救实验；biotin-miR-140-5p pull-down实验。
H19与DBN1直接结合验证
鉴定H19相互作用蛋白并验证DBN1与其直接结合。
RNA pull-down结合质谱鉴定相互作用蛋白；Western blot验证DBN1；RIP实验验证H19与DBN1结合；RNA FISH和免疫荧光共定位；截短突变体分析结合区域。
DBN1功能研究
验证DBN1在PSC分化中的作用及其与MYOD的调控关系。
siRNA敲低和过表达DBN1检测分化标志物；检测H19敲低对DBN1的影响；ChIP-qPCR验证MYOD结合H19和DBN1启动子；敲低MYOD检测DBN1和H19表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞分离 | 胶原酶II | Gibco | 17101-015 |
| 细胞培养 | RPMI 1640培养基 | Gibco | A10491-01 |
| 胎牛血清 | Gibco | 10270 | |
| 基质胶 | Corning | 356234 | |
| 鸡胚提取物 | GEMINI | 100-163P | |
| GlutaMax添加剂 | Gibco | 35050-061 | |
| 非必需氨基酸 | Gibco | 11140-050 | |
| 抗生素-抗真菌剂 | Gibco | 15240-062 | |
| 人重组碱性成纤维细胞生长因子 | Gibco | 13256029 | |
| 细胞分化 | 马血清 | HyClone | SH30074.02 |
| RNA提取 | RNAiso试剂 | Takara | 9109 |
| RACE | SMARTer RACE cDNA扩增试剂盒 | Clontech | 634858 |
| 转染 | Lipofectamine 2000转染试剂 | Invitrogen | 11668019 |
| RNA干扰 | 猪H19 siRNA | genepharma | -- |
| SOX4反义寡核苷酸 | Sangon Biotech | -- | |
| DBN1 siRNA | genepharma | -- | |
| MYOD siRNA | genepharma | -- | |
| cDNA合成 | RevertAid第一链cDNA合成试剂盒 | Thermo | k1622 |
| qPCR | SYBR Green染料 | CWBIO | CW0957 |
| LightCycler 480系统 | Roche | -- | |
| Western blot | MYOG抗体 | Abcam | ab1835 |
| MYOD抗体 | Abclonal | A0671 | |
| MYHC抗体 | Milipore | 05-716 | |
| DBN1抗体 | Abclonal | A6366 | |
| SOX4抗体 | Bioss | bs-11208R | |
| HRP标记的山羊抗小鼠IgG | Servicebio | GB23301 | |
| HRP标记的山羊抗兔IgG | Servicebio | GB23303 | |
| ECL底物 | Beyotime | P0018A | |
| β-微管蛋白抗体 | Servicebio | GB13017-2 | |
| 免疫荧光 | Alexa 594标记的驴抗小鼠IgG | Antgene | ANT029 |
| Hoechst 33342染色液 | Sanofi-Aventis | C1022 | |
| 显微镜 | Leica SP8共聚焦显微镜 | Leica | -- |
| 转录组测序 | Illumina HiseqTM 2500测序平台 | Illumina | -- |
| FISH | FISH试剂盒 | Guangzhou RiboBio Co. Ltd. | -- |
| 荧光素酶报告 | 双荧光素酶报告检测系统 | Promega | -- |
| RNA pull-down | 生物素RNA标记混合物 | Roche Life Science | -- |
| T7 RNA聚合酶 | Roche Life Science | -- | |
| RIP | Magna RIP RNA结合蛋白免疫沉淀试剂盒 | Millipore | -- |
| ChIP | ChIP试剂盒 | Beyotime | P2078 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞分离与培养 | PSC分离使用3日龄约克夏公猪，肌肉包括四肢肌肉；分离步骤中胶原酶II消化浓度1 mg/mL，时间2 h；培养使用PM+培养基，Matrigel包被。 阅读提示：Materials and Methods: Animals and PSCs Isolation; PSCs Culture and Differentiation |
| H19敲低 | siH19-3序列，浓度50 nM，转染试剂Lipofectamine 2000，转染后24 h换分化培养基，36 h收获。 阅读提示：Materials and Methods: Transfection of siRNAs; Results: Characterization of H19 and Identification of Its Function in PSCs |
| PSC分化 | 分化培养基DMEM含5%马血清，每日换液，分化时间24 h和36 h。 阅读提示：Materials and Methods: PSCs Culture and Differentiation |
| 转录组测序 | 12个cDNA文库，每组3个重复，比对参考基因组Sus scrofa 11.1，FPKM标准化，DEGseq2鉴定DEGs。 阅读提示：Materials and Methods: Library Construction and Sequencing; Identification of Differentially Expressed Genes (DEGs) |
| 机制验证 | 双荧光素酶报告使用WT和突变H19/SOX4载体；RNA pull-down使用生物素标记H19；RIP使用DBN1抗体；ChIP使用MYOD抗体。 阅读提示：Materials and Methods: Luciferase Reporter Assay; Pull-Down Assay; RNA Pull-Down Assay; RNA Immunoprecipitation (RIP) Assay; Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) Assays |