样本与细胞中circ_0020123表达检测
验证circ_0020123在NSCLC组织和细胞中的表达水平。
通过qRT-PCR检测30对NSCLC肿瘤组织和正常非癌组织，及NSCLC细胞（H1299、H1581、A549）和16HBE细胞中circ_0020123的表达。
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Circ_0020123通过海绵吸附miR-142-3p上调ZFX表达促进非小细胞肺癌进展
Circ_0020123 Increases ZFX Expression to Facilitate Non-Small Cell Lung Cancer Progression by Sponging miR-142-3p.
实验完整度
高包含qRT-PCR、CCK8、Transwell、双荧光素酶、RIP等体外功能实验，以及裸鼠移植瘤模型体内验证，并涉及机制验证（circ_0020123/miR-142-3p/ZFX轴）。
主要模型
NSCLC细胞系H1299 NSCLC细胞系A549 NSCLC细胞系H1581 支气管上皮细胞16HBE BALB/c裸鼠皮下移植瘤模型
重点核对
si-circ_0020123#1和si-circ_0020123#2有效敲低circ_0020123而不影响线性PDZD8表达 miR-142-3p inhibitor逆转si-circ_0020123对细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响 miR-142-3p mimic和inhibitor的转染效率验证 si-ZFX#1和si-ZFX#2有效敲低ZFX 裸鼠皮下注射2×10^6 H1299细胞，4周后评估肿瘤体积和重量
摘要
背景：环状RNA（circRNA）参与多种癌症的进展，并已被证明是癌症治疗的重要潜在靶点。Circ_0020123已被发现作为癌基因参与非小细胞肺癌（NSCLC）的恶性进展。因此，探索circ_0020123调控NSCLC进展的新机制将有助于我们更好地理解其在NSCLC中的作用。方法：通过实时定量PCR（qRT-PCR）检测组织和细胞中circ_0020123、microRNA（miR）-142-3p和锌指蛋白X连锁（ZFX）的相对表达水平。使用细胞计数试剂盒8（CCK8）实验、集落形成实验、流式细胞术和Transwell实验评估细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭。Western blot（WB）分析用于检测相对蛋白水平。此外，通过双荧光素酶报告基因实验和RNA免疫沉淀（RIP）实验证实了miR-142-3p与circ_0020123或ZFX之间的相互作用。结果：我们的结果表明，circ_0020123在NSCLC中上调，其敲低可抑制NSCLC细胞增殖、迁移、侵袭，并促进凋亡。发现circ_0020123与miR-142-3p相互作用。circ_0020123沉默对NSCLC进展的抑制作用可被miR-142-3p抑制剂逆转。ZFX可被miR-142-3p靶向。ZFX的沉默可阻碍NSCLC的进展，并消除miR-142-3p抑制剂对NSCLC进展的促进作用。此外，circ_0020123沉默通过miR-142-3p/ZFX轴抑制NSCLC肿瘤发生。结论：这些发现表明，circ_0020123可能通过调节miR-142-3p/ZFX轴促进NSCLC进展，可能成为NSCLC的潜在治疗靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- circ_0020123促进非小细胞肺癌进展的新机制及其调控网络。
- 核心机制
- circ_0020123通过海绵吸附miR-142-3p，解除miR-142-3p对ZFX的抑制作用，从而上调ZFX表达，促进NSCLC进展。
- 主要证据
- 在NSCLC组织和细胞中，circ_0020123高表达而miR-142-3p低表达；双荧光素酶和RIP实验证实circ_0020123与miR-142-3p、miR-142-3p与ZFX的相互作用；体外功能实验表明敲低circ_0020123或ZFX抑制增殖、迁移、侵袭并促进凋亡，miR-142-3p抑制剂逆转circ_0020123敲低效应；裸鼠移植瘤模型显示敲低circ_0020123抑制肿瘤生长并影响miR-142-3p和ZFX表达。
- 研究意义
- 为circ_0020123在NSCLC中的研究提供了新机制，并为其作为NSCLC治疗靶点提供了理论依据。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
circ_0020123敲低对NSCLC细胞功能的影响
评估敲低circ_0020123对NSCLC细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响。
使用si-circ_0020123#1/#2转染H1299和A549细胞，通过CCK8、集落形成、流式细胞术、Transwell实验及WB检测环蛋白D1、Bax、MMP-9蛋白水平。
circ_0020123与miR-142-3p的相互作用验证
验证circ_0020123是否直接结合并海绵吸附miR-142-3p。
通过双荧光素酶报告基因实验和RIP实验验证circ_0020123与miR-142-3p的结合，并检测NSCLC组织和细胞中miR-142-3p表达。
miR-142-3p抑制剂逆转circ_0020123敲低效应
验证circ_0020123的功能是否依赖于miR-142-3p。
共转染si-circ_0020123#1和miR-142-3p抑制剂到H1299和A549细胞，检测细胞功能变化及miR-142-3p和蛋白表达。
验证ZFX为miR-142-3p靶基因
验证miR-142-3p是否直接靶向ZFX。
使用双荧光素酶报告基因实验验证结合，检测NSCLC组织和细胞中ZFX表达，及miR-142-3p mimic/inhibitor对ZFX蛋白的影响。
ZFX敲低对NSCLC细胞功能的影响
评估ZFX在NSCLC细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭中的作用。
使用si-ZFX#1/#2转染H1299和A549细胞，通过CCK8、集落形成、流式细胞术、Transwell实验及WB检测相关蛋白。
ZFX敲低逆转miR-142-3p抑制剂对NSCLC的促进作用
验证miR-142-3p是否通过ZFX调控NSCLC进展。
共转染in-miR-142-3p和si-ZFX#1到H1299和A549细胞，检测细胞功能及ZFX表达。
circ_0020123通过miR-142-3p调控ZFX表达
验证circ_0020123对ZFX的调控依赖于miR-142-3p。
共转染si-circ_0020123#1和in-miR-142-3p，检测ZFX mRNA和蛋白表达。
体内验证circ_0020123敲低抑制NSCLC肿瘤发生
在体内验证circ_0020123敲低对NSCLC肿瘤生长的影响。
将转染sh-circ_0020123或sh-NC的H1299细胞皮下注射到裸鼠，每周测量肿瘤体积，4周后取瘤称重，并检测肿瘤组织中circ_0020123、miR-142-3p和ZFX表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
验证细胞功能变化
验证分子表达变化
验证机制链路
评估体内效果
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI-1640培养基 | Gibco | -- |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | -- | |
| 细胞转染 | Lipofectamine 3000试剂 | Invitrogen | -- |
| RNA提取 | RNeasy Mini试剂盒 | Qiagen | -- |
| 逆转录 | M-MLV逆转录酶试剂盒 | Invitrogen | -- |
| qRT-PCR | SYBR GreenER qPCR SuperMix Universal | Invitrogen | -- |
| 集落形成实验 | 结晶紫溶液 | Beyotime | -- |
| 凋亡检测 | Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒 | Sigma-Aldrich | -- |
| 迁移和侵袭实验 | Transwell小室 | Millipore | -- |
| 侵袭实验 | 基质胶 | -- | -- |
| Western blot | RIPA裂解液 | Beyotime | -- |
| PVDF膜 | Millipore | -- | |
| 抗Cyclin D1抗体 | Bioss | bs-20596R | |
| 抗Bax抗体 | Bioss | bs-28034R | |
| 抗MMP-9抗体 | Bioss | bs-4593R | |
| 抗ZFX抗体 | Bioss | bs-12306R | |
| 抗GAPDH抗体 | Bioss | bs-2188R | |
| 羊抗兔IgG | Bioss | bs-0295G | |
| BeyoECL Star ECL化学发光试剂盒 | Beyotime | -- | |
| 双荧光素酶报告基因实验 | pmirGLO载体 | Promega | -- |
| 双荧光素酶报告基因检测系统 | Promega | -- | |
| RIP实验 | Magna RIP RNA结合蛋白免疫沉淀试剂盒 | Millipore | -- |
| 磁珠蛋白A/G | -- | -- | |
| 统计分析 | Graphpad Prism软件 | GraphPad | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 样本收集 | 配对肿瘤和正常组织数量：30对；组织来源：惠州市中心人民医院手术患者；伦理批准。 阅读提示：见Materials and Methods中的Samples Collection |
| 细胞培养 | 细胞系：H1299、H1581、A549（ATCC），16HBE（Procell）；培养基：RPMI-1640（Gibco）含10% FBS和1%青霉素-链霉素；培养条件：37°C，5% CO2。 阅读提示：见Materials and Methods中的Cell Culture and Transfection |
| 细胞转染 | siRNA序列、miRNA mimics/inhibitors、转染试剂Lipofectamine 3000（Invitrogen）、转染浓度：50 nM。 阅读提示：见Materials and Methods中的Cell Culture and Transfection |
| qRT-PCR | 内参GAPDH和U6；引物序列；2^-ΔΔCT方法。 阅读提示：见Materials and Methods中的Quantitative Real-Time PCR |
| 细胞增殖分析 | CCK8实验：1000细胞/孔；集落形成实验：150细胞/孔，培养14天。 阅读提示：见Materials and Methods中的Cell Proliferation Analysis |
| 凋亡分析 | 凋亡试剂盒：Annexin V-FITC（Sigma-Aldrich）；染色15分钟；流式细胞术。 阅读提示：见Materials and Methods中的Cell Apoptosis Analysis |
| 迁移和侵袭分析 | Transwell小室（Millipore）；侵袭时预包被Matrigel；迁移不包被；迁移/侵袭时间：24小时。 阅读提示：见Materials and Methods中的Cell Migration and Invasion Analysis |
| Western blot | 抗体稀释比例：Cyclin D1 (1:2000)，Bax (1:1000)，MMP-9 (1:2000)，ZFX (1:1000)，GAPDH (1:1000)；二抗稀释比例：1:20000。 阅读提示：见Materials and Methods中的Western Blot |
| 双荧光素酶报告基因实验 | 载体：pmirGLO；转染时间：48小时；转染组合：报道载体+miR-142-3p mimic或miR-NC。 阅读提示：见Materials and Methods中的Dual-Luciferase Reporter Assay |
| RIP实验 | 使用Magna RIP试剂盒；抗体：anti-Ago2或anti-IgG；随后qRT-PCR检测circ_0020123和miR-142-3p。 阅读提示：见Materials and Methods中的RNA Immunoprecipitation Assay |
| 动物实验 | 动物品系：BALB/c裸鼠（雄性）；数量：10只，每组5只；注射细胞数：2×10^6 H1299细胞；观察时间：4周。 阅读提示：见Materials and Methods中的Mice Xenograft Models |