单细胞转录组分析
鉴定小鼠SAN中不同的细胞亚群及其分子特征
分离小鼠SAN、心房和心室细胞，进行单细胞RNA测序（Smart-seq2），通过t-SNE聚类分析，鉴定细胞亚群
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单细胞RNA测序揭示哺乳动物窦房结的细胞和分子图谱
Cellular and molecular landscape of mammalian sinoatrial node revealed by single-cell RNA sequencing.
实验完整度
高包含多物种单细胞转录组分析、体外hiPSC-CM功能验证、体内AAV介导的基因敲低及心电图检测，并有分子和通路机制分析。
主要模型
小鼠窦房结组织 兔窦房结组织 食蟹猴窦房结组织 人诱导多能干细胞来源心肌细胞 新生大鼠心肌细胞
重点核对
单细胞RNA测序样本量：小鼠771个细胞（21只小鼠SAN的718个细胞和4只小鼠的53个心房/心室细胞）；兔343个细胞（6只兔）；猴296个细胞（12只猴） Vsnl1敲低：siRNA转染hiPSC-CMs（对照组n=12，si-Vsnl1组n=15，独立检测数）；AAV9-miRNAi-Vsnl1尾静脉注射（AAV9-miRNAi-Control n=4，AAV9-miRNAi-Vsnl1 n=3，生物学独立动物数） AAV9-miRNAi-Vsnl1滴度：1.92×10^13 v.g./ml；对照1.70×10^13 v.g./ml；注射剂量：2×10^11病毒基因组颗粒 hiPSC-CMs接种密度：MEA板5×10^5细胞/板（或50,000细胞/孔） 心率记录：植入遥测发射器（ETA-F10），手术恢复2周后记录ECG
摘要
窦房结（SAN）内固有产生的生物电脉冲触发哺乳动物心脏的收缩。尽管在一个多世纪前就被发现，但支撑其在心脏中关键功能的SAN的分子和细胞特征仍是未知领域。在这里，我们通过单细胞RNA测序鉴定了小鼠SAN中的四个不同的转录簇。对差异表达基因的功能分析确定了一个富含电发生基因的核心细胞簇。在兔和食蟹猴的SAN中也观察到类似的细胞特征。值得注意的是，在小鼠中，核心细胞簇标记物Vsnl1在SAN中高表达，但在心房或心室中几乎检测不到，表明Vsnl1是一个潜在的SAN标记物。重要的是，Vsnl1的缺失不仅降低了人诱导多能干细胞来源的心肌细胞（hiPSC-CMs）的搏动率，也降低了小鼠的心率。此外，加权基因共表达网络分析（WGCNA）揭示了调控小鼠SAN功能的核心基因调控网络。总的来说，这些发现揭示了在单细胞分辨率下SAN的全转录组图谱，代表了对理解SAN的生物学和病理学的进展。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 哺乳动物窦房结（SAN）的细胞类型异质性及其起搏活动的核心分子调控网络是什么？
- 核心机制
- Vsnl1作为核心细胞簇标记物，通过影响电压依赖性钙通道（Cav3.3、Cav1.3）和钙转运体（Serca2、Ryr2）的表达参与SAN的起搏活动调控。
- 主要证据
- 单细胞RNA测序鉴定小鼠SAN的四个细胞簇并确定核心簇，Vsnl1在核心簇中特异高表达；Vsnl1敲低降低hiPSC-CMs搏动率（降低44.8%）和小鼠心率；WGCNA分析揭示核心基因共表达网络。
- 研究意义
- 揭示了SAN的单细胞转录组图谱和核心调控网络，为理解SAN的生物学和病理学提供了基础，并为起搏细胞谱系追踪和生物起搏器研究奠定基础。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
标记物表达模式验证
验证核心细胞簇标记物（如Vsnl1）在心脏组织中的表达特异性
通过qPCR和免疫荧光检测Vsnl1、Dlgap1、Unc80等基因在不同心脏区域的表达
体外功能验证
检测核心标记物对心肌细胞自发搏动频率的影响
在hiPSC-CMs中敲低Vsnl1和其他簇标记物，使用微电极阵列（MEA）记录搏动率
体内功能验证
验证Vsnl1对小鼠心率的影响
通过AAV9介导的基因敲低Vsnl1，植入遥测发射器记录清醒小鼠的心电图和心率
基因调控网络分析
识别调控SAN起搏活动的核心基因共表达网络
对小鼠单细胞数据执行WGCNA，鉴定共表达模块，并进行GO和蛋白互作网络分析
跨物种比较
比较不同哺乳动物（小鼠、兔、猴）SAN的细胞转录组特征
分离兔和猴的SAN细胞，进行单细胞RNA测序、聚类分析和功能注释，并与小鼠比较
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
单细胞转录组分析
体内功能验证
蛋白表达验证
细胞分离与培养
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 单细胞分离 | II型胶原酶 | Worthington | -- |
| 弹性蛋白酶 | Worthington | -- | |
| 蛋白酶 | Sigma | -- | |
| 单细胞RNA测序 | SuperScript III逆转录酶 | Invitrogen | 18080044 |
| KAPA聚合酶 | Kapa Biosystems | KK2601 | |
| Agencourt AMPure XP磁珠 | Beckman Coulter | A63881 | |
| Nextera标签化 | Illumina | FC-131-1096 | |
| ERCC外源RNA对照 | Invitrogen | 4456740 | |
| RNA提取 | GenElute单细胞RNA纯化试剂盒 | Sigma | RNB300 |
| TRIzol试剂 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 逆转录 | PrimeScript RT试剂盒 | Takara Bio | RR037A |
| qPCR | SYBR Green试剂盒 | TOYOBO CO | QPK-201 |
| QuantStudio 6 Flex实时荧光定量PCR系统 | Applied Biosystems | -- | |
| 免疫荧光 | HCN4抗体 | Sigma | SAB5200035 |
| 连接蛋白43抗体 | CST | 3512 | |
| VSNL1抗体 | Gene Tex | GTX115039 | |
| I型胶原蛋白抗体 | Abcam | ab21286 | |
| DLGAP1抗体 | Affbiotech | AF0308 | |
| UNC80抗体 | BIOSS | BS-12121R | |
| APOLD1抗体 | Novus Biologicals | NBP2-58460 | |
| RYR3抗体 | Novus Biologicals | NBP2-76962 | |
| 连接蛋白40抗体 | Invitrogen | 37-8900 | |
| 心肌肌钙蛋白T抗体 | Abcam | ab8295 | |
| 山羊抗小鼠IgG Alexa Fluor 488 | Abcam | ab150113 | |
| 山羊抗兔IgG Alexa Fluor 555 | Abcam | ab150078 | |
| 山羊抗小鼠IgG Alexa Fluor 633 | Sigma | SAB4600139 | |
| 免疫荧光成像 | 共聚焦显微镜（Leica TCS SP8） | Leica | TCS SP8 |
| hiPSC-CM培养 | 心肌细胞培养基 | Help Stem Cell Innovations | HELP4001 |
| 心肌细胞消化液 | Help Stem Cell Innovations | HELP4005 | |
| siRNA转染 | 脂质体转染试剂RNAiMAX | Invitrogen | 13778-150 |
| MEA记录 | Maestro MEA 24孔板 | Axion Biosystems | -- |
| Maestro系统 | Axion Biosystems | -- | |
| 新生大鼠心肌细胞分离 | Hank's平衡盐溶液 | Gibco | 14175095 |
| 胰蛋白酶 | Gibco | 15090046 | |
| IV型胶原酶 | Sigma | C4-22-1G | |
| 脱氧核糖核酸酶II | Sigma | D8764 | |
| 新生大鼠心肌细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | 11965092 |
| 5-溴-2'-脱氧尿苷 | Sigma | B5002 | |
| AAV载体构建 | BLOCK-iT Pol II miR RNAi表达载体试剂盒 | Invitrogen | K493500 |
| AAV生成 | AAV2/9-CMV_bGI-eGFP-miRNAi载体 | Taitool Bioscience | -- |
| 体内实验 | 遥测发射器（ETA-F10） | Data Sciences International | ETA-F10 |
| 信号记录 | Ponemah软件 | Datasci International | -- |
| 蛋白提取 | RIPA裂解液 | Beyotime Biotechnology | P0013C |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | Roche | 04693132001 | |
| Western blot | PVDF膜 | Millipore | IPVH00010 |
| GAPDH抗体 | Proteintech | 60004-1-Ig | |
| 二抗 | Invitrogen | A32730 | |
| 二抗 | Invitrogen | A32735 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 单细胞分离 | 酶消化条件（弹性蛋白酶0.3 mg/ml，胶原酶II型0.8 mg/ml，蛋白酶0.13 mg/ml）；消化时间20-25分钟 阅读提示：Methods: Isolation of single cells |
| 单细胞RNA测序 | Smart-seq2 protocol；测序平台Illumina HiSeq X10；配对末端2×150 bp read length 阅读提示：Methods: Single-cell RNA sequencing |
| scRNA-seq数据分析 | 使用Seurat版本2.3；聚类参数：resolution=0.6；使用2500个心脏相关基因；DEG筛选min.pct=0.25 阅读提示：Methods: Identification of cell clusters and DEGs |
| qPCR | 引物序列见补充数据7；使用GAPDH作为内参；2^-ΔΔCt方法 阅读提示：Methods: Quantitative real-time PCR |
| 免疫荧光 | 一抗稀释比例（HCN4 1:50，VSNL1 1:50等）；二抗稀释比例1:200；石蜡切片厚度6μm 阅读提示：Methods: Histology and immunofluorescence histochemistry |
| hiPSC-CM培养和转染 | hiPSC-CMs来源（Help Stem Cell Innovations）；培养天数；使用lipofectamine RNAiMAX转染siRNA 阅读提示：Methods: Culture and transfection of hiPSC-derived CMs |
| MEA记录 | 细胞接种密度50,000细胞/孔；记录时间（转染后第4天）；平衡时间15分钟 阅读提示：Methods: MEA recordings |
| 新生大鼠心肌细胞分离 | 1-3日龄SD大鼠；消化酶浓度：胰蛋白酶0.125 mg/ml，IV型胶原酶0.1 mg/ml，DNase II 10 mg/ml；反复消化8-10次 阅读提示：Methods: Isolation and culture of neonatal rat cardiomyocytes |
| AAV注射 | 病毒滴度（Vsnl1: 1.92×10^13 v.g./ml；对照：1.70×10^13 v.g./ml）；注射剂量2×10^11病毒基因组颗粒；尾静脉注射 阅读提示：Methods: AAVs generation & telemetric recordings |
| 遥测记录 | 植入ETA-F10发射器；手术恢复2周；记录参数按制造商说明 阅读提示：Methods: The telemetric recordings |