NPCs的分离与培养
获取用于制备条件培养基的NPCs
从SD大鼠分离髓核组织，培养NPCs（P1-P3），收集P3条件培养基。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
髓核细胞条件培养基在低氧条件下促进间充质干细胞向髓核样细胞分化
Nucleus Pulposus Cell Conditioned Medium Promotes Mesenchymal Stem Cell Differentiation into Nucleus Pulposus-Like Cells under Hypoxic Conditions.
实验完整度
中包含细胞分离培养、条件培养基处理、qPCR、Western blot和免疫荧光验证，但缺乏动物模型或体内验证。
主要模型
大鼠髓核细胞（NPCs） 大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）
重点核对
NPC条件培养基浓度（50%或100%） 低氧条件（2% O2） 处理时间（7天） 对照培养基（DMEM/F-12含10% FBS）
摘要
腰痛（LBP）是全球主要的身体和社会经济挑战。髓核（NP）与椎间盘（IVD）退变引起的腰痛直接相关。椎间盘退变主要是由衰老和退变过程中椎间盘内的结构和基质相关变化引起的。间充质干细胞（MSCs）在特定刺激条件下可分化为多种间充质谱系。本研究旨在评估髓核细胞（NPC）条件培养基促进MSCs表达的有效性，并确认脊柱研究兴趣小组最近推荐的健康NP表型标记物的表达。在常氧和低氧条件下使用定量聚合酶链反应（qPCR）和蛋白质印迹法检测表达。qPCR和蛋白质印迹表明，与常氧条件下培养的MSCs相比，在低氧条件下培养并用50%或100% NPC条件培养基处理的MSCs中，NP标记物表达显著上调。与对照组相比，在100% NPC条件培养基存在下上调最高（aggrecan，p < 0.01；brachyury，p < 0.05；collagen II，p < 0.001；KRT8，p < 0.01；KRT19，p < 0.001；和Shh，p < 0.01）。与对照组相比，用50% NPC条件培养基处理的MSCs中基因表达水平也显示上调（collagen II，p < 0.05；KRT8，p < 0.05；和KRT19，p < 0.01）。这些发现表明，NPC条件培养基刺激MSCs分化为具有独特特征的NP样表型。结果可为IVD再生的策略提供信息。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 髓核细胞条件培养基是否能促进间充质干细胞向髓核样细胞分化？
- 核心机制
- NPC条件培养基含有分泌因子，在低氧环境下刺激MSCs向NP样表型分化，表现为NP标记物（aggrecan、brachyury、collagen II、KRT8、KRT19和Shh）表达上调。
- 主要证据
- qPCR和Western blot显示，低氧条件下用100% NPC条件培养基处理的MSCs中，aggrecan、brachyury、collagen II、KRT8、KRT19和Shh表达显著上调。
- 研究意义
- 为椎间盘再生的细胞疗法提供科学依据。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
MSCs的培养与处理
评估NPC条件培养基对MSCs分化相关基因和蛋白表达的影响
将大鼠骨髓MSCs用50%或100% NPC条件培养基处理7天，对照用常规培养基。
基因表达分析
检测NP标记物在mRNA水平的表达变化
通过qPCR检测NPCs和MSCs中多个基因的表达。
蛋白表达分析
检测NP标记物在蛋白水平的表达变化
通过Western blotting检测相关蛋白的表达。
免疫荧光染色
验证NPCs中蛋白表达定位和强度
对常氧和低氧培养的NPCs进行免疫荧光染色。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM/F-12培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 青霉素-链霉素溶液 | -- | -- | |
| 胰蛋白酶-EDTA溶液 | Life Technologies | -- | |
| 低氧培养 | 3131培养箱 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| RNA提取 | 通用RNA提取试剂盒 | Takara | 9767 |
| 逆转录 | PrimeScript RT试剂盒（含gDNA Eraser） | Takara | RR047 |
| qPCR | SYBR Green PCR预混液 | Roche Applied Science | -- |
| StepOnePlus PCR系统 | Applied Biosystems | -- | |
| Western blotting | 全细胞裂解缓冲液 | KeyGen | -- |
| BCA蛋白浓度测定试剂盒 | Beyotime | -- | |
| PVDF膜 | EMD Millipore | -- | |
| SuperSignal West FEMTO化学发光底物 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| ab6721 | Abcam | -- | |
| 免疫荧光 | Alexa Fluor 594山羊抗兔二抗 | Invitrogen | -- |
| DAPI | Sigma-Aldrich | -- | |
| 荧光显微镜 | Olympus | -- | |
| 统计 | GraphPad Prism软件 | GraphPad Software, Inc. | ver. 7.04 |
| Western blotting/免疫荧光 | HIF-1α抗体 | Abcam | ab2185 |
| HIF-2α抗体 | Abcam | ab199 | |
| Glut-1抗体 | Abcam | ab15309 | |
| Shh抗体 | Abcam | ab19897 | |
| Brachyury抗体 | Bioss | bs-10669R | |
| Aggrecan抗体 | Bioss | bs-11655R | |
| Collagen II抗体 | Abcam | ab116242 | |
| Western blotting | CD24抗体 | Proteintech | 10600-1-AP |
| 免疫荧光 | CD24抗体 | Bioss | bs-4891R |
| Western blotting/免疫荧光 | 细胞角蛋白8抗体 | Abcam | ab59400 |
| 细胞角蛋白18抗体 | Abcam | ab181597 | |
| 细胞角蛋白19抗体 | Abcam | ab84632 | |
| Western blotting | β-肌动蛋白抗体 | Abcam | ab8227 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| NPC分离与培养 | 大鼠品系、年龄、体重；NP组织分离步骤；培养基组成；培养条件；传代代数 阅读提示：Methods 2.1 |
| MSC培养与处理 | MSC来源；处理浓度（50%或100%）；处理时间（7天）；培养条件（低氧或常氧） 阅读提示：Methods 2.2和2.3 |
| 低氧培养 | 低氧气体组成（93% N2, 5% CO2, 2% O2）；培养箱型号；温度 阅读提示：Methods 2.3 |
| 基因表达分析 | 引物序列；RNA提取试剂盒；逆转录试剂盒；qPCR反应体系；内参基因 阅读提示：Methods 2.4和Table 1 |
| 蛋白表达分析 | 裂解缓冲液；蛋白定量方法；SDS-PAGE浓度；抗体稀释比例；二抗信息 阅读提示：Methods 2.5和Table 2 |
| 免疫荧光染色 | 固定液浓度和时间；封闭液成分；抗体稀释比例；二抗信息；核染色 阅读提示：Methods 2.6和Table 2 |
| 统计分析 | 实验重复次数；统计软件；统计方法；显著性阈值 阅读提示：Methods 2.7 |