卒中模型建立及PARP14表达分析
探究卒中后PARP14的表达变化及其与ADP-核糖基化的关系
建立光血栓性卒中（PT）小鼠模型，在术后第1、3、7、14天检测梗死周围区PAR水平和PARP14表达（Western blot、qPCR、免疫荧光）。
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PARP14通过LPAR5抑制小胶质细胞活化促进卒中后功能恢复
PARP14 inhibits microglial activation via LPAR5 to promote post-stroke functional recovery.
实验完整度
高包含体内PT小鼠模型（基因敲低、药理抑制、过表达）和体外OGD处理的小胶质细胞模型，结合行为学、梗死体积、免疫印迹、ELISA、免疫荧光、RNA测序及自噬通量检测，进行功能与机制验证。
主要模型
光血栓性卒中（PT）小鼠模型 原代小鼠小胶质细胞 BV-2小胶质细胞系
重点核对
PARP14表达水平在PT后梗死周围区升高 PARP14敲低或抑制加重功能损伤和梗死体积 PARP14过表达改善功能恢复和减小梗死体积 PARP14调节小胶质细胞自噬（MAP1LC3B-II和SQSTM1水平） PARP14通过下调LPAR5抑制小胶质细胞活化
摘要
卒中是一个主要的公共卫生问题，导致全球范围内的高死亡率和致残率，但目前除了使用PLAT（组织型纤溶酶原激活剂）外，尚无有效的药物治疗。在这里，我们显示在光血栓性卒中（PT）小鼠的梗死周围区，PARP14（聚（ADP-核糖）聚合酶家族成员14）水平显著升高。基因敲低和药理抑制PARP14加重了PT小鼠的功能障碍并增加了梗死体积，而PARP14过表达则表现出相反的效果。此外，PARP14在小胶质细胞中丰富表达，下调PARP14增加了卒中后小胶质细胞的活化，而过表达PARP14减轻了小胶质细胞的活化，可能通过小胶质细胞巨自噬/自噬调节。机制上，过表达PARP14抑制了Lpar5（溶血磷脂酸受体5）基因的转录，从而抑制卒中后小胶质细胞的活化。总之，PARP14是卒中诱导的信号，限制小胶质细胞活化并促进功能恢复，可作为开发新的卒中治疗药物的新靶点。此外，这些发现可能有助于合理使用各种PARP抑制剂。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- PARP14在卒中后是否影响小胶质细胞活化及功能恢复？
- 核心机制
- PARP14通过诱导小胶质细胞自噬并下调Lpar5基因转录，抑制卒中诱导的小胶质细胞活化，从而促进功能恢复。
- 主要证据
- PT小鼠模型显示PARP14过表达改善功能恢复并减小梗死体积，而敲低或抑制加重损伤；体外OGD模型证实PARP14促进自噬（增加MAP1LC3B-II和减少SQSTM1）并抑制NOS2表达，且下调LPAR5；RNA测序和qPCR验证Lpar5为下游靶基因。
- 研究意义
- PARP14作为卒中诱导的信号，限制小胶质细胞活化并促进功能恢复，可作为卒中治疗的新靶点，并为PARP抑制剂的合理使用提供参考。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
PARP14基因敲低或过表达对卒中结局的影响
验证PARP14在卒中后功能恢复和梗死体积中的作用
通过立体定位注射慢病毒（shRNA-Parp14或LV-Parp14）到小鼠皮层，在术前指定时间点注射，然后进行行为学测试和梗死体积测量。
药理抑制PARP14对卒中结局的影响
验证PARP14抑制剂H10对功能恢复和炎症的影响
在PT术后2小时向梗死周围皮层注射H10（1 μmol/L或10 μmol/L），进行行为学测试、梗死体积测量和炎症相关蛋白/细胞因子检测。
体外OGD模型验证PARP14对小胶质细胞活化的作用
确认PARP14调节小胶质细胞活化的直接作用
使用原代小鼠小胶质细胞和BV-2细胞，进行OGD处理，并通过敲低或过表达PARP14检测NOS2等活化标志物的表达。
自噬通路分析
探究PARP14是否通过调节自噬影响小胶质细胞活化
检测OGD处理下MAP1LC3B-II和SQSTM1水平变化，使用mRFP-GFP-MAP1LC3B腺病毒评估自噬流，并用雷帕霉素和3-MA验证自噬对NOS2表达的影响。
转录组测序寻找下游靶基因
鉴定PARP14调控的下游基因，揭示其抑制小胶质细胞活化的机制
对PARP14过表达的原代小胶质细胞进行RNA测序（OGD处理），筛选差异表达基因，并进行qPCR验证。
验证LPAR5的作用
验证LPAR5是否为PARP14的关键下游靶点，影响小胶质细胞活化
在OGD处理的原代小胶质细胞中，通过siRNA敲低Lpar5，检测NOS2表达；同时检测PT小鼠中H10对LPAR5表达的影响。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 动物实验 | 玫瑰红 | Sigma Aldrich | 330000 |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | -- |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 胰蛋白酶-EDTA | Gibco | 25200056 | |
| Neurobasal培养基 | Gibco | 21103049 | |
| GlutaMAX添加剂 | Gibco | 35050061 | |
| B27添加剂 | Gibco | 17504044 | |
| 粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 | -- | -- | |
| 免疫染色 | 曲拉通X-100 | Aladdin | T109027 |
| 山羊血清 | ZSGB-BIO | ZLI-0956 | |
| 抗PARP14抗体 | Sigma Aldrich | HPA012063 | |
| 抗GFAP抗体 | Sigma Aldrich | G3893 | |
| 抗RBFOX3抗体 | Abcam | AB104224 | |
| 抗AIF1抗体 | Wako | 019-19741 | |
| 抗MAP1LC3B抗体 | Sigma Aldrich | L7543 | |
| Alexa Fluor 594山羊抗兔IgG | Invitrogen | A-11037 | |
| Alexa Fluor 488山羊抗兔IgG | Invitrogen | A-11034 | |
| Alexa Fluor 594山羊抗小鼠IgG | Invitrogen | A-11005 | |
| Alexa Fluor 488山羊抗小鼠IgG | Invitrogen | A-11029 | |
| Alexa Fluor 488偶联亲和纯化F(ab)片段山羊抗兔IgG（H+L） | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 111-547-003 | |
| Western blot | 抗NOS2抗体 | Proteintech group | 18985-1-AP |
| 抗PAR抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-56198 | |
| 抗SQSTM1抗体 | Proteintech group | 18420-1-AP | |
| 抗LPAR5抗体 | Bioss | bs-15366R | |
| 抗Flag抗体 | Sigma Aldrich | F3165 | |
| 抗ACTB/β-肌动蛋白抗体 | Proteintech group | 60008-1-Ig | |
| 辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG | Cell Signaling Technology | 7074P2 | |
| 辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG | Cell Signaling Technology | 7076P2 | |
| qPCR | TRIzol试剂 | Invitrogen | 15596026 |
| HiScript Q Select RT SuperMix试剂盒 | Vazyme | R123-01 | |
| AceQ qPCR SYBR Green预混液 | Vazyme | R141-02 | |
| ELISA | 小鼠TNF ELISA试剂盒 | Nanjing Jin Yibai Biological Technology Co. Ltd. | JEB-12474 |
| 小鼠IL1B ELISA试剂盒 | Nanjing Jin Yibai Biological Technology Co. Ltd. | JEB-12787 | |
| 小鼠IL6 ELISA试剂盒 | Nanjing Jin Yibai Biological Technology Co. Ltd. | JEB-12267 | |
| 药理干预 | H10 | 中国药科大学江苏省药物设计与优化重点实验室合成 | -- |
| 雷帕霉素 | Sigma Aldrich | R0395 | |
| 3-甲基腺嘌呤 | Sigma Aldrich | M9281 | |
| 自噬流检测 | mRFP-GFP-MAP1LC3B腺病毒 | HanBio | HB-AP2100001 |
| 基因操作 | 慢病毒载体（shRNA-Parp14，shRNA-Con） | GeneChem Co, Ltd | -- |
| 慢病毒载体（LV-Parp14，LV-Con） | BrainVTA | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 卒中模型诱导 | 光血栓性卒中（PT）模型的具体参数：Rose Bengal剂量（30 mg/kg，i.v.）、光照强度（12,000 lux）和光照时间（5分钟） 阅读提示：Materials and Methods: Photothrombotic stroke (PT) |
| 慢病毒注射 | 慢病毒注射的时间点（shRNA-Parp14在术前3天，LV-Parp14在术前4天）和立体定位坐标（AP: 0 mm, ML: 1.5 mm, DV: 1.3 mm） 阅读提示：Materials and Methods: Lentiviral vector construction and stereotaxic injection |
| 药理抑制 | PARP14抑制剂H10的剂量（1 μmol/L或10 μmol/L）、给药时间（PT术后2小时）和给药途径（颅内注射） 阅读提示：Figure 3 legend 和 Materials and Methods: Reagents |
| 行为学测试 | 行为学测试的时间点（基线及术后第3、7、14天）和具体参数（网格大小、圆筒尺寸、粘纸面积等） 阅读提示：Materials and Methods: Grid-walking task, Cylinder task, Adhesive removal test |
| 体外OGD模型 | OGD处理时间（6小时或12小时）、氧气剥夺条件（5% CO2和95% N2）以及细胞类型（原代小胶质细胞或BV-2细胞） 阅读提示：Materials and Methods: OGD treatment |
| 自噬检测 | mRFP-GFP-MAP1LC3B腺病毒感染及氯喹（CQ）处理浓度和时间，自噬流定量方法 阅读提示：Figure 8 legend 和 Materials and Methods: Cell cultures |
| Western blot 分析 | 使用的抗体及其稀释比例（如anti-NOS2 1:1000等） 阅读提示：Materials and Methods: Western blot analysis |
| qPCR分析 | 引物序列（见表S1） 阅读提示：Supplemental Table S1 |