耐药细胞糖酵解特征分析
比较顺铂敏感与耐药细胞的糖酵解水平，验证耐药细胞是否具有增强的糖酵解表型。
比较A549与A549/DDP细胞的葡萄糖消耗、乳酸产生以及关键糖酵解酶（HK1、HK2、PFKP、PKM1/2、PKM2、GLUT1、PDH、LDHA）在mRNA和蛋白水平的表达。
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参麦注射液通过AKT-mTOR-c-Myc信号通路抑制顺铂耐药A549/DDP细胞的糖酵解并增强顺铂的细胞毒性
Shenmai Injection Supresses Glycolysis and Enhances Cisplatin Cytotoxicity in Cisplatin-Resistant A549/DDP Cells via the AKT-mTOR-c-Myc Signaling Pathway.
实验完整度
中包含体外细胞实验（增殖、凋亡、糖酵解检测）及通路抑制剂验证（LY294002、雷帕霉素、10058-F4），但缺乏动物实验和临床样本验证。
主要模型
A549/DDP细胞（人肺腺癌顺铂耐药细胞系） A549细胞（人肺腺癌细胞系）
重点核对
细胞系：A549/DDP（顺铂耐药）与A549（顺铂敏感） SMI浓度：IC5（10 mg/mL）、IC10（15 mg/mL）、IC20（20 mg/mL）；顺铂浓度：IC20（23.3 μM） 处理时间：24小时或5天 抑制剂：LY294002（20 μM）、雷帕霉素（5 nM）、10058-F4（20 μM） 检测方法：CCK-8、EdU、Western blot、RT-qPCR、葡萄糖消耗和乳酸生成测定
摘要
肿瘤细胞，尤其是耐药细胞，即使在氧气充足的条件下也主要通过糖酵解支持生长，这被称为Warburg效应。葡萄糖代谢重编程是导致肿瘤耐药的主要因素之一。先前关于参麦注射液（SMI）——一种中药制剂——的研究表明，其与化疗药物联合使用时能增强肿瘤治疗效果，但机制尚不清楚。本研究探讨了SMI联合顺铂对顺铂耐药肺腺癌A549/DDP细胞的作用。结果表明，与顺铂敏感A549细胞相比，顺铂耐药A549/DDP细胞表现出葡萄糖消耗和乳酸产生增加，以及关键糖酵解酶（包括己糖激酶2（HK2）、丙酮酸激酶M1/2（PKM1/2）、丙酮酸激酶M2（PKM2）、葡萄糖转运蛋白1（GLUT1）和乳酸脱氢酶A（LDHA））表达水平升高。在A549/DDP细胞中，SMI联合顺铂导致关键糖酵解酶（如HK2、PKM1/2、GLUT1和丙酮酸脱氢酶（PDH））的表达水平显著降低。此外，我们发现SMI和顺铂的联合能通过降低p-Akt、p-mTOR和c-Myc的表达水平抑制细胞增殖并促进细胞凋亡，进而降低糖酵解水平。这些结果表明，SMI通过葡萄糖代谢重编程增强了顺铂的抗肿瘤作用。因此，SMI与顺铂联合可能是治疗顺铂耐药非小细胞肺癌的潜在治疗策略。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- SMI联合顺铂是否能通过抑制糖酵解增强顺铂对耐药肺腺癌细胞的细胞毒性，其机制如何？
- 核心机制
- SMI联合顺铂通过下调AKT-mTOR-c-Myc信号通路中p-AKT、p-mTOR和c-Myc的表达，抑制关键糖酵解酶（如HK2、PKM1/2、GLUT1、PDH）的表达，从而抑制糖酵解，增强细胞毒性。
- 主要证据
- 在A549/DDP细胞中，SMI联合顺铂降低了葡萄糖消耗和乳酸产生，抑制了细胞增殖并促进凋亡；通路抑制剂实验证实了AKT-mTOR-c-Myc通路参与介导糖酵解抑制。
- 研究意义
- 研究为SMI联合顺铂治疗顺铂耐药非小细胞肺癌提供了理论依据。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
SMI与顺铂单独及联合的细胞毒性评估
确定SMI和顺铂单独及联合对A549/DDP细胞的抑制效果，计算IC值。
使用CCK-8法检测不同浓度SMI或顺铂处理24小时后的细胞活力，计算IC5、IC10、IC20和IC50；评估不同浓度SMI（IC5、IC10、IC20）与顺铂IC20联合处理的抑制率。
SMI联合顺铂对糖酵解和增殖的影响
验证SMI联合顺铂是否能抑制A549/DDP细胞的糖酵解和增殖，并促进凋亡。
检测SMI联合顺铂处理后细胞的葡萄糖消耗、乳酸产生、关键糖酵解酶表达、细胞增殖（EdU）、凋亡相关蛋白表达以及细胞生长曲线。
信号通路关键蛋白表达检测
检测SMI联合顺铂对AKT-mTOR-c-Myc信号通路关键蛋白表达的影响。
通过Western blot检测处理后A549/DDP细胞中AKT、p-AKT（Ser473、Thr308）、mTOR、p-mTOR（Ser2448）、c-Myc及HIF-1α的表达水平。
信号通路抑制剂验证
验证AKT-mTOR-c-Myc通路在SMI联合顺铂抑制糖酵解中的作用。
使用LY294002（PI3K抑制剂）、雷帕霉素（mTOR抑制剂）和10058-F4（c-Myc抑制剂）预处理A549/DDP细胞，再联合SMI（20 mg/mL）和顺铂（23.3 μM）处理，检测相关蛋白和糖酵解酶的表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM/高糖培养基 | Hyclone | -- |
| 胎牛血清 | Scitecher | -- | |
| 青霉素 | Genview | -- | |
| 链霉素 | Genview | -- | |
| 药物处理 | 参麦注射液 | Shineway Pharmaceutical Co., Ltd. | -- |
| 顺铂 | Sigma Aldrich Company | -- | |
| 抑制剂处理 | LY294002 | Abmole Bioscience | -- |
| 雷帕霉素 | Abmole Bioscience | -- | |
| 10058-F4 | Abmole Bioscience | -- | |
| 细胞活力检测 | CCK-8溶液 | Apexbio | -- |
| 糖酵解检测 | 葡萄糖检测试剂盒 | Applygen | -- |
| 乳酸检测试剂盒 | Jiancheng Bioengineering Institute | -- | |
| EdU检测 | EdU试剂盒 | Donghuan Biotech | -- |
| RNA提取与RT-qPCR | RNAiso plus | Takara | -- |
| RT-qPCR | 逆转录试剂盒 | Takara | -- |
| SYBR Green预混液 | Vazyme | -- | |
| Western blot | RIPA裂解液 | Beyotime | -- |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Leagene | -- | |
| PVDF膜 | Millipore | -- | |
| 增强化学发光Western blot检测试剂盒 | Vazyme | -- | |
| 荧光显微镜成像 | 荧光显微镜 | Zeiss | -- |
| Western blot成像 | 生物成像系统 | DNR | -- |
| 抗体 | HK2抗体 | Cell signaling technology | 2867 |
| PFKP抗体 | Cell signaling technology | 5412 | |
| PKM2抗体 | Cell signaling technology | 4053 | |
| PKM1/2抗体 | Cell signaling technology | 3186 | |
| PDHX抗体 | Cell signaling technology | 3205 | |
| AKT抗体 | Cell signaling technology | 4691 | |
| p-Akt (Thr308)抗体 | Cell signaling technology | 2965 | |
| p-Akt (Ser473)抗体 | Bioss | 33281 | |
| mTOR抗体 | Cell signaling technology | 2983 | |
| p-mTOR (Ser2448)抗体 | Cell signaling technology | 5536 | |
| HIF-1α抗体 | Cell signaling technology | 3716 | |
| HK1抗体 | Abcom | ab65069 | |
| GLUT1抗体 | Abcom | ab652 | |
| LDHA抗体 | Abcom | ab125683 | |
| β-肌动蛋白抗体 | Abcom | ab179467 | |
| Caspase 3/p17/19抗体 | Proteintech | 19677-10-AP | |
| BAX抗体 | Proteintech | 50599-2-lg | |
| Bcl 2抗体 | Proteintech | 26593-1-AP | |
| 山羊抗兔IgG | Zsbio | ZB-2301 | |
| 山羊抗小鼠IgG | Zsbio | ZB-2305 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | 细胞系来源和培养条件（培养基、血清浓度、抗生素、CO2浓度、温度）；耐药维持浓度和处理周期。 阅读提示：Materials and Methods 2.1 Cell Lines and Cell Culture |
| 药物处理 | SMI和顺铂的浓度（IC5、IC10、IC20），处理时间，联合用药顺序。 阅读提示：Materials and Methods 2.3 Inhibition Assay of SMI and Cisplatin |
| 糖酵解检测 | 细胞接种密度、处理时间、葡萄糖消耗和乳酸产生的测定方法及归一化方式。 阅读提示：Materials and Methods 2.4 Glucose Consumption and Lactate Production Assay |
| 细胞增殖检测 | EdU实验的细胞数、处理时间、EdU浓度和孵育时间。 阅读提示：Materials and Methods 2.5 EdU Assay |
| 信号通路抑制剂 | 抑制剂浓度、预处理时间、联合药物浓度和处理时间。 阅读提示：Materials and Methods 2.6 Inhibitor Assay |
| 蛋白表达检测 | 蛋白提取方法、上样量、电泳条件、抗体稀释比例。 阅读提示：Materials and Methods 2.8 Western Blot Analysis 和 Table 1 |