冷暴露模型建立与Hsp70表达检测
验证冷暴露是否在体内和体外诱导Hsp70表达
将仔猪在4°C冷暴露6h和12h,采集十二指肠、空肠和回肠;Vero E6细胞在4°C或25°C冷暴露6h或12h后恢复培养,通过qRT-PCR和蛋白质印迹检测Hsp70 mRNA和蛋白水平。
Cold Exposure-Induced Up-Regulation of Hsp70 Positively Regulates PEDV mRNA Synthesis and Protein Expression In Vitro.
包含体内外模型,功能验证(过表达、敲低、抑制剂)和机制初步验证,但缺乏体内PEDV感染实验和机制深入分析。
猪小肠上皮细胞(IPEC-J2) 非洲绿猴肾上皮细胞(Vero E6) 冷暴露仔猪肠道组织
冷暴露温度4°C和25°C,处理6h和12h PEDV感染剂量(MOI=1) 过表达质粒pTSB-Hsp70转染量2.5μg/well siRNA-Hsp70转染浓度40 nmol/well VER155008浓度5μM及其添加时间点
提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证冷暴露是否在体内和体外诱导Hsp70表达
将仔猪在4°C冷暴露6h和12h,采集十二指肠、空肠和回肠;Vero E6细胞在4°C或25°C冷暴露6h或12h后恢复培养,通过qRT-PCR和蛋白质印迹检测Hsp70 mRNA和蛋白水平。
评估过表达Hsp70是否促进PEDV mRNA合成和蛋白表达
构建pTSB-Hsp70质粒,转染Vero E6和IPEC-J2细胞,24小时后感染PEDV(MOI=1),48小时后收集样本检测PEDV ORF3 mRNA和N蛋白水平。
验证敲低Hsp70是否抑制PEDV mRNA合成和蛋白表达
设计三个siRNA靶向猴Hsp70,转染Vero E6细胞,24小时后感染PEDV(MOI=1),24小时后检测PEDV RNA和蛋白水平。
确定Hsp70在PEDV生命周期中发挥作用的阶段
Vero E6细胞感染PEDV(MOI=1),在吸附、入侵、复制等不同阶段添加VER155008(5μM),24小时后通过蛋白质印迹检测PEDV N蛋白水平。
按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | -- |
| 病毒繁殖与细胞培养 | 胰蛋白酶 | Gibco | -- |
| 药物处理 | VER155008 | Sigma | SML0271 |
| Western blotting | 小鼠抗Hsp70单克隆抗体 | Abcam | ab5439 |
| 小鼠抗GAPDH单克隆抗体 | Bioss | bsm-33033M | |
| 山羊抗小鼠IgG/HRP | Bioss | -- | |
| RNA提取 | RNA提取试剂盒 | Tiangen Biotech | -- |
| 逆转录 | PrimeScript RT Master Mix | Takala | -- |
| qRT-PCR | NovoStar SYBR qPCR SuperMix Plus | Novoprotein | E096-01B |
| 质粒转染 | Exfect 2000转染试剂 | Vazyme | -- |
| 质粒构建 | pTSB质粒 | TranSheepBio | TSE02 |
| 细胞活力检测 | MTT细胞毒性检测试剂盒 | Beyotime | -- |
| Western blotting | Luminata Crescendo Western HRP底物 | Merck KGaA | -- |
| Amersham Imager 600成像仪 | GE Healthcare | -- | |
| qRT-PCR | ABI QuantStudio 3实时荧光定量PCR系统 | Applied Biosystems | -- |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 冷暴露处理 | 冷暴露温度(4°C或25°C)和时间(6h或12h),仔猪年龄、分组和样本处理 阅读提示:参见2.2和2.3节 |
| 细胞培养 | Vero E6和IPEC-J2细胞的培养条件(培养基、FBS浓度、抗生素) 阅读提示:参见2.3和2.6节 |
| 质粒转染 | pTSB-Hsp70质粒构建和转染浓度(2.5μg/well) 阅读提示:参见2.6节 |
| siRNA敲低 | siRNA序列、转染浓度(40 nmol/well) 阅读提示:参见2.7节 |
| 药物处理 | VER155008浓度(5μM)和添加时间点 阅读提示:参见2.9节和Figure 4A |