冷暴露诱导的Hsp70上调在体外正调控PEDV mRNA合成和蛋白表达

Cold Exposure-Induced Up-Regulation of Hsp70 Positively Regulates PEDV mRNA Synthesis and Protein Expression In Vitro.

作者信息Fanzhi Kong, Yaru Xu, Wei Ran, Baishuang Yin, Li Feng, Dongbo Sun
PMID32224931
期刊Pathogens
发布时间2020-03-26
DOI10.3390/pathogens9040246

实验完整度

包含体内外模型,功能验证(过表达、敲低、抑制剂)和机制初步验证,但缺乏体内PEDV感染实验和机制深入分析。

主要模型

猪小肠上皮细胞(IPEC-J2) 非洲绿猴肾上皮细胞(Vero E6) 冷暴露仔猪肠道组织

重点核对

冷暴露温度4°C和25°C,处理6h和12h PEDV感染剂量(MOI=1) 过表达质粒pTSB-Hsp70转染量2.5μg/well siRNA-Hsp70转染浓度40 nmol/well VER155008浓度5μM及其添加时间点

摘要

猪流行性腹泻(PED)是由猪流行性腹泻病毒(PEDV)引起的一种高度传染性肠道传染病。PEDV作为一种新发和再发的地方流行性猪病毒,对中国及其他国家的养猪业造成了巨大的经济损失。在中国,PED的发生表现出显著的季节性变化,通常在冬季暴发。PED的流行特征可能与环境温度的变化高度相关。然而,PED季节性发生的分子机制仍不清楚。人们普遍观察到,低温环境会上调宿主热休克蛋白70(Hsp70)的表达。本文中,我们表明在冷暴露猪的肠道和冷暴露的Vero E6细胞中,Hsp70的核苷酸和蛋白质水平上调。我们发现,过表达Hsp70可增加Vero E6和IPEC-J2细胞中PEDV mRNA合成和蛋白表达,而siRNA介导的Hsp70敲低以及VER155008介导的Hsp70抑制则导致Vero E6细胞中病毒mRNA合成和蛋白表达的抑制。这些数据表明,Hsp70正调控PEDV mRNA合成和蛋白表达,这有助于理解PED流行的季节性以及未来新型抗病毒疗法的开发。

实验结论

提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。

研究问题
冷暴露诱导的Hsp70是否影响PEDV mRNA合成和蛋白表达,从而解释PED的季节性流行?
核心机制
冷暴露上调宿主Hsp70表达,Hsp70通过促进病毒入侵和复制阶段正调控PEDV mRNA合成和蛋白表达。
主要证据
冷暴露仔猪肠道和Vero E6细胞中Hsp70表达上调;过表达Hsp70增强PEDV mRNA和N蛋白水平,siRNA敲低或VER155008抑制则降低病毒mRNA和蛋白水平。
研究意义
结果有助于理解PED流行的季节性,并为开发新型抗病毒疗法提供潜在靶点。

研究路径

按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

1

冷暴露模型建立与Hsp70表达检测

验证冷暴露是否在体内和体外诱导Hsp70表达

将仔猪在4°C冷暴露6h和12h,采集十二指肠、空肠和回肠;Vero E6细胞在4°C或25°C冷暴露6h或12h后恢复培养,通过qRT-PCR和蛋白质印迹检测Hsp70 mRNA和蛋白水平。

2

Hsp70过表达对PEDV复制的影响

评估过表达Hsp70是否促进PEDV mRNA合成和蛋白表达

构建pTSB-Hsp70质粒,转染Vero E6和IPEC-J2细胞,24小时后感染PEDV(MOI=1),48小时后收集样本检测PEDV ORF3 mRNA和N蛋白水平。

3

Hsp70敲低对PEDV复制的影响

验证敲低Hsp70是否抑制PEDV mRNA合成和蛋白表达

设计三个siRNA靶向猴Hsp70,转染Vero E6细胞,24小时后感染PEDV(MOI=1),24小时后检测PEDV RNA和蛋白水平。

4

Hsp70抑制剂VER155008的时间添加实验

确定Hsp70在PEDV生命周期中发挥作用的阶段

Vero E6细胞感染PEDV(MOI=1),在吸附、入侵、复制等不同阶段添加VER155008(5μM),24小时后通过蛋白质印迹检测PEDV N蛋白水平。

研究方法

按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。

验证样本或模型特征
验证细胞功能变化
验证分子表达变化
验证机制链路
数据分析与统计

产品清单

实验环节名称品牌货号
DMEM培养基Gibco--
胰蛋白酶Gibco--
VER155008SigmaSML0271
小鼠抗Hsp70单克隆抗体Abcamab5439
小鼠抗GAPDH单克隆抗体Biossbsm-33033M
山羊抗小鼠IgG/HRPBioss--
RNA提取试剂盒Tiangen Biotech--
PrimeScript RT Master MixTakala--
NovoStar SYBR qPCR SuperMix PlusNovoproteinE096-01B
Exfect 2000转染试剂Vazyme--
pTSB质粒TranSheepBioTSE02
MTT细胞毒性检测试剂盒Beyotime--
Luminata Crescendo Western HRP底物Merck KGaA--
Amersham Imager 600成像仪GE Healthcare--
ABI QuantStudio 3实时荧光定量PCR系统Applied Biosystems--

关键环节

汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

环节核对要点
冷暴露处理
冷暴露温度(4°C或25°C)和时间(6h或12h),仔猪年龄、分组和样本处理
阅读提示:参见2.2和2.3节
细胞培养
Vero E6和IPEC-J2细胞的培养条件(培养基、FBS浓度、抗生素)
阅读提示:参见2.3和2.6节
质粒转染
pTSB-Hsp70质粒构建和转染浓度(2.5μg/well)
阅读提示:参见2.6节
siRNA敲低
siRNA序列、转染浓度(40 nmol/well)
阅读提示:参见2.7节
药物处理
VER155008浓度(5μM)和添加时间点
阅读提示:参见2.9节和Figure 4A